2010年版藥典三部附錄Ⅻ

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅻ

《中華人民共和國藥典》（2010年版）三部附錄Ⅻ

2 附錄Ⅻ A 無菌檢查法

無菌檢查法系用於檢查藥典要求無菌的生物製品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發現微生物污染。

無菌檢查應在環境潔淨度10000級下的局部潔淨度100級的單向流空氣區域內或隔離系統中進行，其全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。隔離系統應按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔淨度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。

無菌檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培訓。

2.1 培養基

2.1.1 培養基的製備

培養基可按以下處方製備，亦可使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配製後應採用驗證合格的滅菌程序滅菌。製備好的培養基應保存在2～25℃避光的環境，若保存於非密閉容器中，一般可在3周內使用；若保存於密閉容器中，一般可在1年內使用。

1．硫乙醇酸鹽流體培養基

酪腖（胰酶水解）    15.0g

酵母浸出粉    5.0g

葡萄糖    5.0g

氯化鈉    2.5g

L-胱氨酸    0.5g

新配製的0.1%刃天青溶液    1.0ml

硫乙醇酸鈉    0.5g （或硫乙醇酸） （0.3ml）

瓊脂    0.75g

水    1000ml

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調pH值爲弱鹼性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調pH值使滅菌後爲7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束後培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2，滅菌。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5，否則，須經100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘）後，迅速冷卻，只限加熱1次，並防止被污染。

2．改良馬丁培養基

腖    5.0g

磷酸氫二鉀    1.0g

酵母浸出粉  2.0g

硫酸鎂    0.5g

葡萄糖    20.0g

水    1000ml

除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調pH值約爲6.8，煮沸；加入葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調pH值使滅菌後爲6.4±0.2，分裝，滅菌。

3．選擇性培養基

按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基的處方及製法，在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法驗證試驗。

4．營養肉湯培養基

腖    10.0g

氯化鈉    5.0g

牛肉浸出粉  3.0g

水    1000ml

取上述成分混合，微溫溶解，調pH值爲弱鹼性，煮沸，濾清，調pH值使滅菌後爲7.2±0.2，分裝，滅菌。

5．營養瓊脂培養基

按上述營養肉湯培養基的處方及製法，加入14.0g瓊脂，調pH值使滅菌後爲7.2±0.2，分裝，滅菌。

6．改良馬丁瓊脂培養基

按改良馬丁培養基的處方及製法，加入14.0g瓊脂，調pH值使滅菌後爲6.4±0.2，分裝，滅菌。

2.1.2 培養基的適用性檢查

無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。

2.1.3 培養基的無菌性檢查

每批培養基隨機抽取不少於10支（瓶），5支（瓶）置30～35℃、另5支（瓶）置20～25℃培養14天，均應無菌生長。

2.2 靈敏度檢查

2.2.1 菌種

培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍乾燥菌種爲第0代），試驗用菌種應採用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC （B） 26003]

銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） [CMCC （B） 10104]

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [CMCC （B） 63501]

生孢梭菌（Clostridium sporogenes） [CMCC （B） 64941]

白色念珠菌 （Candida albicans） [CMCC （F） 98001]

黑麴黴（Aspergillus niger） [CMCC （F） 98003]

2.2.2 菌液製備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35℃培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，20～25℃培養24～48小時，上述培養物用0.9%氯化鈉溶液製成每1ml含蔭數小於100CFU（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml無菌的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用無菌的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液製成每1ml含孢子數小於100CFU的孢子懸液。

菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存於2～8℃可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。

2.3 培養基接種

取每管裝量爲12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種小於100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種，作爲空白對照，置30～35℃培養3天；取每管裝量爲9ml的改良馬丁培養基5支，分別接種小於100CFU的白色念珠菌、黑麴黴各2支，另1支不接種，作爲空白對照，置20～25℃培養5天。逐日觀察結果。

2.4 結果判定

空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。稀釋液、沖洗液及其製備方法

稀釋液、沖洗液配製後應採用驗證合格的滅菌程序滅菌。

（1）0.1%蛋白腖水溶液  稱取蛋白腖1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。

（2） pH7.0氯化鈉－蛋白腖緩衝液  稱取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白腖1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。

（3）0.9%氯化鈉溶液  稱取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌（僅用於上述2種溶液不適用時使用）。

根據供試品的特性可選用其他經驗證過的適宜的溶液作爲稀釋液、沖洗液。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌後加入表面活性劑或中和劑等。

2.5 方法驗證試驗

當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所採用的方法適合於該產品的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發生改變時，檢查方法應重新驗證。驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。

2.5.1 菌種及菌液製備

同培養基靈敏度檢查。

2.5.2 薄膜過濾法

取每種培養基規定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加入小於100CFU的試驗菌，過濾。將培養基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作爲對照，細菌置30～35℃、真菌置20～25℃培養3～5天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。

2.5.3 直接接種法

取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接入小於100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管，分別接入小於100CFU的白色念珠菌、黑麴黴各2管。其中1管接入每支培養基規定量的供試品量，另1管作爲對照，細菌置30～35℃、真菌置20～25℃培養3～5天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。

2.5.4 結果判定

與對照管比較，如含供試品的各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可採用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，並重新進行方法驗證試驗。

驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。

2.6 供試品的無菌檢查

2.6.1 抽驗數量

係指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量（支或瓶）。成品每亞批均應進行無菌檢查。除另有規定外，原液、半成品及成品按表1規定，上市產品監督檢驗按表2規定。

2.6.2 接種量

係指每個最小包裝的最少取樣量（ml或g）。除另有規定外，接種供試品量按表3規定。若採用直接接種法，按接種量要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中[兩種培養基的接種支（瓶）數之比爲2：1]；若採用薄膜過濾法，應採用三聯薄膜過濾器，其中兩聯加入硫乙醇酸鹽流體培養基，另一聯加入改良馬丁培養基。只要供試品特性允許，應將所有容器內的內容物全部過濾。

2.6.3 陽性對照

以金黃色葡萄球菌作爲陽性對照菌。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照試驗的菌液製備同培養基靈敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌液製備方法，加菌量小於100CFU。陽性對照也可在供試品無菌檢查培養14天后，取其中1份硫乙醇酸鹽流體培養基，加入小於100CFU陽性對照菌，作爲陽性對照。陽性對照置30～35℃培養48～72小時應生長良好。

2.6.4 陰性對照

供試品無菌檢查時，應取相應溶劑、稀釋液和沖洗液同法操作，作爲陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物生長無毒性。無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應採用薄膜過濾法。供試品的無菌檢查所採用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。

操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒。如果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作啓開容器，取出內容物。

2.7 供試品處理及接種培養基

除另有規定外，按下列方法進行。

2.7.1 1．薄膜過濾法

採用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑應不大於0.45μm，直徑約爲50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前後的完整性。

水溶性供試品溶液過濾前先將少量的沖洗液過濾，以潤溼濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分乾燥。爲發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試品溶液經薄膜過濾後，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般爲100ml，總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。

2.7.1.1 水溶液供試品

取規定量，每支（瓶）供試品裝量爲5ml及以下者，全部轉移至含適宜稀釋液100ml的無菌容器內，混勻，立即過濾；每支（瓶）供試品裝量爲5ml以上者直接過濾，或全部轉移至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數一般不少於3次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗。沖洗後，2個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養基各100ml，另一濾器中加入改良馬丁培養基100ml。

2.7.1.2 水溶性固體供試品

取規定量，加適宜的稀釋液溶解或按標籤說明覆溶，然後照水溶液供試品項下的方法操作。

2.7.1.3 非水溶性供試品

取規定量，混合溶於含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液300ml的無菌容器內，充分混合，立即過濾。用含0.1%～1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數一般不少於3次。加入含或不含聚山梨酯80的培養基。其他照水溶液供試品項下的方法操作。

2.7.1.4 可溶於十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品

取規定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯①中，劇烈振搖，使供試品充分溶解。如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44℃，並趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，於含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試品溶液中加入不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作爲供試品溶液過濾。過濾後濾膜沖洗及加入培養基照非水溶性供試品項下的方法操作。

注：①無菌十四烷酸異丙酯的製備採用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑爲0. 22Fcm的脂溶性濾膜（140℃乾熱滅菌2小時）過濾。

2.7.1.5 無菌氣（噴）霧劑供試品

取規定量，將各容器置至少-20℃的冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鑽一小孔，釋放拋射劑後再無菌開啓容器，並將供試品溶液轉移至無菌容器中，然後照水溶液或非水溶性製劑供試品項下的方法操作。

2.7.1.6 裝有藥物的注射器供試品

取規定量，將注射器中的內容物（若需要可吸入稀釋液或標籤所示的溶劑溶解）直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾，然後按水溶性供試品項下方法操作。

同時應採用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。

2.7.2 2．直接接種法

直接接種法適用於無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。取規定量供試品，等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中（2種培養基的接種支數或瓶數之比爲2:1）。除另有規定外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積，不得大於培養基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少於10ml。培養基的用量和高度同方法驗證試驗。

2.7.2.1 混懸液等非澄清水溶液供試品

取規定量，等量分別接種至各管培養基中。

2.7.2.2 固體供試品

取規定量，加入適宜的稀釋劑溶解，或按標籤說明覆溶後混合，等量分別接種至各管培養基中。

2.7.2.3 非水溶性供試品

取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其他適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化；等量分別接種至各管培養基中，或等量分別直接接種至含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的各管培養基中。

2.7.2.4 培養及觀察

將上述接種後的硫乙醇酸鹽流體培養基平均分成兩份，一份置30～35℃培養14天；另一份與接種後的改良馬丁培養基置20～25℃培養14天，培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長。如在加入供試品後或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天后，不能從外觀上判斷有無菌生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中及營養瓊脂斜面和改良馬丁瓊脂斜面培養基上，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基及營養瓊脂和改良馬丁瓊脂斜面培養基上是否有菌生長；或取培養液（物）塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時做菌種鑑定。

2.7.2.5 結果判定

陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。

若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁並確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少1個條件時方可判試驗結果無效：

（1）無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。

（2）回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染的因素。

（3）供試品管中生長的微生物經鑑定後，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。

試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。

表1  出廠製品不同規格及原液和半成品最少抽驗數量

表2 上市制品監督抽驗數量

表3 不同規格製品的最少接種量

3 附錄Ⅻ B 支原體檢查法

主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨牀治療用細胞進行支原體檢查時，應同時進行培養法和指示細胞法（DNA染色法）。病毒類疫苗的病毒收穫液、原液採用培養法檢查支原體，必要時，亦可採用指示細胞法篩選培養基。也可採用經國家藥品檢定機構認可的其他方法。

3.1 第一法  培養法

3.1.1 推薦培養基及其處方

（1）支原體肉湯培養基

豬胃消化液    500ml

氯化鈉    2.5g

牛肉浸液（1：2）500ml

葡萄糖    5.0g

酵母浸粉    5.0g

酚紅    0.02g

pH值7.6±0.2。於121℃滅菌15分鐘。

（2）精氨酸支原體肉湯培養基

豬胃消化液    500ml

葡萄糖    1.0g

牛肉浸液（1：2） 500ml

L-精氨酸    2.0g

酵母浸粉    5.0g

酚紅    0.02g

氯化鈉    2.5g

pH值7.1±0.2，於121℃滅菌15分鐘。

（3）支原體半流體培養基  按（1）項處方配製，培養基中不加酚紅，加入瓊脂2.5～3.0g。

（4）支原體瓊脂培養基  按（1）項處方配製，培養基中不加酚紅，加入瓊脂13.0～15.0g。

3.1.2 培養基靈敏度檢查（變色單位試驗法）

（1）菌種

肺炎支原體（ATCC 15531）、口腔支原體（ATCC23714），由國家藥品檢定機構分發。

（2）操作  將菌種接種於適宜的支原體培養基中，經36℃±1℃培養至培養基變色，盲傳2代後，將培養物接種到待檢培養基中，做10倍系列稀釋，肺炎支原體稀釋至10^-7～10^-9，接種在支原體肉湯培養基內；口腔支原體稀釋至10^-3～10^-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基內。每個稀釋度接種3支試管，置36℃±1℃培養7～14天，觀察培養基變色結果。

（3）結果判定  以接種後培養基管數的2/3以上呈現變色的最高稀釋度爲該培養基的靈敏度。

液體培養基的靈敏度：肺炎支原體（ATCC 15531）應達到10^-8，口腔支原體（ATCC 23714）應達到10^-4。

3.1.3 檢查法

（1）供試品如在分裝後24小時以內進行支原體檢查者可貯存於2～8℃；超過24小時應置-20℃以下貯存。

（2）檢查支原體採用支原體半流體培養基和支原體肉湯培養基（或支原體瓊脂培養基）。支原體半流體培養基（或瓊脂培養基）在使用前應煮沸10～15分鐘，冷卻至56℃左右，然後加入滅能新生牛血清（培養基與血清體積比爲8:2），並可酌情加入適量青黴素，充分搖勻。液體培養基除無需煮沸外，使用前亦應同樣補加上述成分。

取每支裝量爲10ml的支原體半流體培養基（已冷至36℃±1℃）和支原體肉湯培養基各4支，每支培養基接種供試品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培養21天。於接種後的第7天從4支中取2支進行次代培養，每1支培養基轉種支原體半流體培養基及支原體肉湯培養基各2支，置36℃±1℃培養21天，每隔3天觀察1次。

（3）結果判定  培養結束時，如接種供試品的培養基均無支原體生長，則供試品判爲合格；如疑有支原體生長，可取加倍量供試品複試，如無支原體生長，供試品判爲合格，如仍有支原體生長，則供試品判爲不合格。

3.1.4 【附註】

質量檢定部門應會同培養基製造部門定期抽檢支原體培養基靈敏度。

3.2 第二法  指示細胞培養法（DNA染色法）

將供試品接種於指示細胞（無污染的Vero細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞）中培養後，用特異熒光染料染色。如供試品污染支原體，在熒光顯微鏡下可見附在細胞表面的支原體DNA着色。

3.2.1 試劑

（1）二苯甲酰胺熒光染料濃縮液  稱取二苯甲酰胺熒光染料5mg，加入100ml不含酚紅和碳酸氫鈉的Hank's平衡鹽溶液中，室溫下用磁力攪拌器攪拌30～40分鐘，使完全溶解，-20℃避光保存。

（2）二苯甲酰胺熒光染料工作液  無酚紅和碳酸氫鈉的Hank's溶液100ml中加入二苯甲酰胺熒光染料濃縮液1ml．混勻。

（3）固定液  醋酸：甲醇（體積比1:3）混合溶液。

（4）封片液  量取0.1mol/L枸櫞酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液27.8ml、甘油50.0ml，混勻，調pH值至5.5。

3.2.2 培養基及指示細胞

（1） DMEM完全培養基。

（2） DMEM無抗生素培養基。

（3）指示細胞（已證明無支原體污染的Vero細胞或其他傳代細胞）  取培養的Vero細胞經消化後，製成每1ml含10⁵的細胞懸液，以每孔0.5ml接種6孔細胞培養板或其他容器，每孔再加無抗生素培養基3ml，於36℃±1℃、5%二氧化碳條件下培養過夜，備用。

3.2.3 供試品處理

（1）細胞培養物  將供試品經無抗生素培養液至少傳1代，然後取細胞已長滿的且3天未換液的細胞培養上清液待檢。

（2）毒種懸液  如該毒種對指示細胞可形成病變並影響結果判定時，應用對支原體無抑制作用的特異抗血清中和病毒後或用不產生細胞病變的另一種指示細胞進行檢查。

（3）其他供試品  檢查時所選用的指示細胞應爲該供試品對其生長無影響的細胞。

3.2.4 測定法

於製備好的指示細胞培養板中加入供試品（細胞培養上清液）2ml（毒種或其他供試品至少1ml），於36℃±1℃、5%二氧化碳條件下培養3～5天。指示細胞培養物至少傳代1次，末次傳代培養用含蓋玻片的6孔培養板培養3～5天后，吸出培養孔中的培養液，加入固定液5ml，放置5分鐘，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分鐘，吸出固定液，使蓋玻片在空氣中乾燥，加二苯甲酰胺熒光染料（或其他DNA染料）工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，吸出染液，每孔用水5ml洗3次，吸出水，蓋玻片於空氣中乾燥，取潔淨載玻片加封片液1滴，分別將盞玻片面向下蓋在封片液上製成封片。用熒光顯微鏡觀察。

用無抗生素培養基2ml替代供試品，同法操作，作爲陰性對照。

用已知陽性的供試品標準菌株2ml替代供試品，同法操作，作爲陽性對照。

3.2.5 結果判定

（1）陰性對照  僅見指示細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。

（2）陽性對照  熒光顯微鏡下除細胞外，可見大小不等、不規則的熒光着色顆粒。

當陰性及陽性對照結果均成立時，試驗有效。

如供試品爲陰性，則供試品判爲合格；如供試品爲陽性或可疑時，應進行重試；如供試品仍爲陽性時，供試品判爲不合格。

4 附錄Ⅻ C 病毒外源因子檢查法

病毒類製品在毒種選育和生產過程中，經常使用動物或細胞基質培養，因此，有可能造成外源因子（特別是外源病毒因子）的污染。爲了保證製品質量，需要對毒種和細胞進行外源因子的檢測。

4.1 病毒種子批外源因子檢查

對病毒主種子批或工作種子批，應抽取足夠檢測試驗需要量的供試品進行病毒外源因子檢測。在試驗前應用非人源和非猴源（特殊情況除外）的特異性抗體中和本病毒。製備抗血清（或單克隆抗體）所用的免疫原應採用與生產疫苗（或製品）不同種而且無外源因子污染的細胞（或動物）製備。如果病毒曾在禽類組織或細胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來製備。若用雞胚，應來自SPF雞羣。

4.1.1 1.動物試驗法

（1）小鼠試驗法  取15～20g小鼠至少10只，用經抗血清中和後的病毒懸液，每隻腦內接種0.03ml，同時腹腔接種0.5ml，至少觀察21天。在觀察期內至少有80%最初接種的小鼠存活，試驗纔有效。如果沒有小鼠出現病毒感染，爲符合要求。解剖所有在試驗24小時後死亡或有患病體徵的小鼠，直接肉眼觀察其病理改變，並將有病變的相應組織懸液通過腦內和腹腔接種另外至少5只15～20g小鼠，觀察21天，如果沒有小鼠出現病毒感染，則符合要求：

（2）乳鼠試驗法  取出生後24小時內的乳鼠至少10只，用經抗血清中和後的病毒懸液，腦內接種0.01ml，同時腹腔接種至少0.1ml。每天觀察，至少14天。在觀察期內至少有80%最初接種的乳鼠存活，試驗纔有效。如果沒有乳鼠出現病毒感染，爲符合要求。解剖所有在試驗24小時後死亡或有患病體徵的乳鼠，直接肉眼觀察其病理改變，並取有病變的相應組織和腦、脾製備成懸液通過腦內和腹腔接種另外至少5只出生後24小時內的乳鼠，每天觀察至接種後第14天，如果沒有乳鼠出現病毒感染，則符合要求。

4.1.2 2．細胞培養法

（1）非血吸附病毒檢查  將經抗血清中和後的病毒懸液，分別接種於人源、猴源和生產用的同種細胞。用人二倍體細胞生產的，還應接種另外一株人二倍體細胞。每種細胞至少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少於培養液總量的25%。於36℃±1℃培養，觀察14天，必要時可更換細胞培養液，未見細胞病變爲陰性；符合要求。

（2）血吸附病毒檢查  上述接種病毒的各種細胞於第6～8天和第14天，每種細胞各取出2瓶進行血吸附病毒檢查。用0.2%～0.5%雞和豚鼠紅細胞混合懸液覆蓋於細胞表面，於2～8℃放置30分鐘，然後於20～25℃放置30分鐘，分別進行鏡檢，觀察紅細胞吸附情況，結果應均爲陰性。

4.1.3 3．雞胚檢查法

在禽類組織或細胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的污染。選用9～11日齡和5～7日齡兩組SPF雞胚，每組至少5只，分別於尿囊腔和卵黃囊接種經抗血清中和後的病毒懸液，每胚0.5ml。孵育7天后，取尿囊液用豚鼠和雞紅細胞混合懸液做血細胞凝集試驗，應爲陰性。被接種的雞胚至少80%存活7天，試驗有效。

4.2 生產用細胞外源因子檢查

4.2.1 1．非血吸附病毒檢查

（1）細胞直接觀察  每批生產用細胞應留取5%（或不少於500ml）細胞懸液不接種病毒，作爲對照細胞加入

與疫苗生產相同的細胞維持液，置與疫苗生產相同的條件下培養，觀察14天，在顯微鏡下觀察是否有細胞病變出現，無細胞病變出現者爲陰性，符合要求。在觀察期末至少有80%的對照細胞培養物存活，試驗纔有效。

（2）細胞培養試驗  上述試驗觀察期末，收取上清液混合後，取適量接種於猴源和人源的細胞培養物，如果疫苗病毒在非猴源或非人源其他細胞系上生產，還應接種於同種不同批細胞。接種量應不少於總量的25%。每種細胞至少檢查5ml上清混合液，置與生產相同的培養條件下培養。無細胞病變者爲陰性，符合要求。

4.2.2 2．血吸附病毒檢查

對上述“細胞直接觀察”及“細胞培養試驗”的細胞培養物，在觀察期末取至少25%的細胞培養瓶進行血吸附病毒檢查（方法同病毒種子批外源因子檢查的血吸附病毒檢查）。

5 附錄Ⅻ D 熱原檢查法

本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。

5.1 供試用家兔

供試用的家兔至少應爲普通級動物，體重1.7～3.0kg，雌兔應無孕。預測體溫前7天即應用同一飼料飼養，在此期間內，體重應不減輕，精神、食慾、排泄等不得有異常現象。未曾用於熱原檢查的家兔，應在檢查供試品前3～7天內預測體溫，進行挑選。挑選的條件與檢查供試品相同，僅不注射藥液，每隔30分鐘測量體溫1次，共測8次，8次體溫均在38.0～39.6℃的範圍內，且最高與最低體溫相差不超過0.4℃的家兔，方可供熱原檢查用。用於熱原檢查後的家兔，若供試品判定爲符合規定，至少應休息48小時後可重複使用；對血液製品、抗毒素和其他同一過敏原的供試品在5天內可重複使用1次。若供試品判定爲不符合規定，則組內全部家兔不得再使用。

5.2 試驗前準備

熱原檢查前1～2天，供試驗用家兔應儘可能處於同一溫度的環境中，實驗室和飼養室的溫度相差不得大於3℃，實驗室的溫度應在17～25℃，熱原檢查全過程中，應注意室溫變化不得大於3℃；並應保持安靜，避免強光照射，避免噪聲干擾和引起動物騷動。家兔在檢查前至少1小時開始停止給食並置於適宜的裝置中，直至檢查完畢。家兔體溫應使用精密度爲±0.1℃的測溫裝置。測溫探頭或肛溫計插入肛門的深度和時間各兔應相同，深度一般約6cm，時間不得少於1.5分鐘。每隔30分鐘測量體溫1次，一般測量2次，2次體溫之差不得超過0.2℃，以此2次體溫的平均值作爲該兔的正常體溫。當日使用的家兔，正常體溫應在38.0～39.6℃的範圍內，同組各兔間正常體溫之差不得超過l℃。

檢查用的注射器、針頭及一切與供試品接觸的器皿，應置幹烤箱中用250℃加熱30分鐘，也可用其他適宜方法除熱原。

5.3 檢查法

供試品或稀釋供試品的無熱原稀釋液，在注射前應預熱至38℃。供試品的注射劑量按各品種的規定，但家兔每1kg體重注射體積不得少於0.5ml，不得大於10ml。

取適用的家兔3只，測定其正常體溫後15分鐘內，自家兔耳靜脈緩緩注入規定劑量並預熱至38℃的供試品溶液，然後每隔30分鐘按前法測量其體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的1次減去正常體溫，即爲該兔體溫升高的溫度。如3只家兔中，有1只家兔體溫升高0.6℃或0.6℃以上；或3只家兔體溫升高均低於0.6℃，但體溫升高的總和達1.4℃或1.4℃以上，應另取5只家兔複試，檢查方法同上。

5.4 結果判定

在初試3只家兔中，體溫升高均低於0.6℃，並且3只家兔體溫升高總和低於1.4℃；或在複試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔僅有1只，並且初試、複試合併8只家兔的體溫升高總和爲3.5℃或3.5℃以下，均認爲供試品的熱原檢查符合規定。在初試的3只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超過1只；或在複試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超過1只；或在初試、複試合併8只家兔的體溫升高總和超過3.5℃，均認爲供試品的熱原檢查不符合規定。

當家兔升溫爲負值時，均以0℃計。

6 附錄Ⅻ E 細菌內毒素檢查法

本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素。以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。

細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，後者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法結果爲準。

本試驗操作過程應防止微生物和內毒素的污染。

細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示，1EU與1個內毒素國際單位（IU）相當。

細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精製而成，用於標定、複覈、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。

細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品爲基準標定其效價，用於試驗中的鱟試劑靈敏度複覈、干擾試驗及各種陽性對照。

細菌內毒素檢查用水系指內毒紊含量小於0.015EU/ml（用於凝膠法）或0.005EU/ml（用於光度測定法）且對內毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。

試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。耐熱器皿常用乾熱滅菌法（250℃、30分鐘以上）去除，也可採用其他確證不干擾細菌內毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素並且對試驗無干擾的器械。

6.1 供試品溶液的製備

某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提製成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的範圍內。對於過酸、過鹼或本身有緩衝能力的供試品，需調節被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、鹼溶液或適宜的緩衝液調節pH值。酸或鹼溶液須用細菌內毒素檢查用水在已去除內毒素的容器中配製。緩衝液必須經過驗證不含內毒素和干擾因子。

6.2 內毒素限值的確定

藥品、生物製品的細菌內毒素限值（L） 一般按以下公式確定：

L=K/M

式中  L爲供試品的細菌內毒素限值，一般以EU/ml、

EU/mg或EU/U（活性單位）表示；

K爲人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K=5EU/（kg·h），放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg·h），鞘內用注射劑K=0.2EU/（kg·h）；

M爲人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按1.62m²計算。注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉換爲每千克體重劑量（M）。

按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨牀用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。

6.3 確定最大有效稀釋倍數（MVD）

最大有效稀釋倍數是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數（1→MVD），在不超過此稀釋倍數的濃度下進行內毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD:

MVD=cL/λ

式中L爲供試品的細菌內毒素限值；

c爲供試品溶液的濃度，當L以EU/ml表示時，則c等於1.0ml/ml，當L以EU/mg或EU/U表示時，c的單位需爲mg/ml或U/ml。如供試品爲注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L；

λ爲在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。

6.4 方法1  凝膠法

凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。

6.4.1 鱟試劑靈敏度複覈試驗

在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒索的最低濃度即爲鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度複覈試驗。

根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然後製成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復溶後的0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內毒素標準溶液，每一個內毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作爲陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻後，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恆溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

將試管從恆溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°，若管內形成凝膠，並且凝膠不變形、不從管壁滑脫者爲陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形並從管壁滑脫者爲陰性。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。

當最大濃度2λ管均爲陽性，最低濃度0.25λ管均爲陰性，陰性對照管爲陰性，試驗方爲有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即爲鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。

λc=antilg（∑X/4）

式中  X爲反應終點濃度的對數值（lg）。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最後一個呈陽性結果的濃度。

當λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時，方可用於細菌內毒素檢查，並以標示靈敏度λ爲該批鱟試劑的靈敏度。

6.4.2 干擾試驗

按表1製備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應爲未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液，按黌試劑靈敏度複覈試驗項下操作。

表1  凝膠法干擾試驗溶液的製備

注：A爲供試品溶液；B爲干擾試驗系列；C爲鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D爲陰性對照。

只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都爲陰性，並且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度複覈範圍內時，試驗方爲有效。按下式計算系列溶液C和B的反應終點濃度的幾何平均值（E_S和E_t）：

E_S=antilg（∑X_S/4）

Et=antilg（∑X_S/4）

式中  X_S、X_t分別爲系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的對數值（lg）。

當E_S在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及E_t在0.5E_S～2E_S（包括0.5E_S和2E_S）時，認爲供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小於MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重複干擾試驗。

可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。爲確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。

當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。

當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。

6.4.3 檢查法

6.4.3.1 （1）凝膠限度試驗

按表2製備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數爲MVD並且已經排除干擾的供試品溶液來製備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度複覈試驗項下操作。

表2 凝膠限度試驗溶液的製備

注：A爲供試品溶液；B爲供試品陽性對照；C爲陽性對照；D爲陰性對照。

結果判斷  保溫60分鐘±2分鐘後觀察結果。若陰性對照溶液D的平行管均爲陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均爲陽性，陽性對照溶液C的平行管均爲陽性，試驗有效。

若溶液A的兩個平行管均爲陰性，判定供試品符合規定；若溶液A的兩個平行管均爲陽性，判定供試品不符合規定。若溶液A的兩個平行管中的一管爲陽性，另一管爲陰性，需進行復試。複試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均爲陰性，判定供試品符合規定；否則判定供試品不符合規定。

6.4.3.2 （2）凝膠半定量試驗

本方法系通過確定反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。按表3製備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度複覈試驗項下操作。

結果判斷  若陰性對照溶液D的平行管均爲陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均爲陽性，系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，試驗有效。

系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，爲每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即爲供試品溶液的內毒素濃度（按公式c_E=antilg（∑X/2）]。如果檢驗時採用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘以稀釋倍數。

如試驗中供試品溶液的所有平行管均爲陰性，應記爲內毒素濃度小於λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記爲小於λ乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數）。如果供試品溶液的所有平行管均爲陽性，應記爲內毒素的濃度大於或等於最大的稀釋倍數乘以λ。

若內毒素濃度小於規定的限值，判定供試品符合規定。若內毒素濃度大手或等於規定的限值，判定供試品不符合規定。

表3 凝膠半定量試驗溶液的製備

注：A爲不超過MVD並且通過干擾試驗的供試品溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最後的稀釋倍數不得超過MVD。

B爲2λ濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽性對照）。

C爲鱟試劑標示靈敏度的對照系列。

D爲陰性對照。

6.5 方法2  光度測定法

光度測定法分爲濁度法和顯色基質法。

濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，可分爲終點濁度法和動態濁度法。終點濁度法是依據反應混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度或透光率）之間存在着量化關係來測定內毒素含量的方法。動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。

顯色基質法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，分爲終點顯色法和動態顯色法。終點顯色法是依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關係來測定內毒素含量的方法。動態顯色法是檢測反應混合物的色度達到某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或檢測色度增長速度的方法。

光度測定試驗需在特定的儀器中進行，溫度一般爲37℃±1℃。

供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。爲保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進行標準曲線的可靠性試驗以及供試品的干擾試驗。

6.5.1 標準曲線的可靠性試驗

當使用新批號的鱟試劑或試驗條件有任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。

用標準內毒素製成溶液，製成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得大於10），最低濃度不得低於所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性對照。當陰性對照的反應時間大於標準曲線最低濃度的反應時間，將全部數據進行線性迴歸分析。

根據線性迴歸分析，標準曲線的相關係數（r）的絕對值應大於或等於0.980，試驗方爲有效。否則須重新試驗。

6.5.2 干擾試驗

選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度（設爲λ_m），作爲供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度。按表4製備溶液A、B、C和D。

按所得線性迴歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量c_t和c_s，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。

R=（c_s-c_t）/λ_m×100%^[1]

當內毒素的回收率在50%～200%之間，則認爲在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。

表4  光度測定法干擾試驗溶液的製備

注：A爲稀釋倍數不超過MVD的供試品溶液。

B爲加入了標準曲線中點或靠近中點的一個已知濃度內毒素的，且與溶液A有相同稀釋倍數的供試品溶液。

C爲如“標準曲線的可靠性試驗”項下描述的，用於製備標準曲線的標準內毒素溶液。

D爲陰性對照。

當內毒素的回收率在50%～200%之間，則認爲在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。

當內毒素的回收率不在指定的範圍內，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素，並重復干擾試驗來驗證處理的有效性。

當鱟試劑、供試品的來源、處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。

6.5.3 檢查法

按“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。

使用系列溶液C生成的標準曲線來計算溶液A的每一個平行管的內毒素濃度。

試驗必須符合以下三個條件方爲有效：

（1）系列溶液C的結果要符合“標準曲線的可靠性試驗”中的要求；

（2）用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度後，計算出的內毒素的回收率要在50%～200%的範圍內；

（3）溶液D的反應時間應大於標準曲線最低濃度的反應時間。

6.5.4 結果判斷

若供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數後，小於規定的內毒素限值，判定供試品符合規定。若大於或等於規定的內毒素限值，判定供試品不符合規定。

注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。

7 附錄Ⅻ F 異常毒性檢查法

本法系生物製品的非特異性毒性的通用安全試驗，檢查製品中是否污染外源性毒性物質以及是否存在意外的不安全因素。

7.1 檢查法

除另有規定外，異常毒性試驗應包括小鼠試驗和豚鼠試驗。

將供試品溫度平衡至室溫，按照規定的給藥途徑緩慢注入動物體內。試驗中應設同批動物空白對照，觀察期內，動物全部健存，且無異常反應，到期時每隻動物體重增加，則，判定試驗成立。

7.1.1 （1）小鼠試驗法

除另有規定外，每批供試品用5只小鼠，注射前每隻小鼠稱體重，應爲18～22g。每隻小鼠腹腔注射供試品0.5ml，觀察7天。觀察期內，小鼠應全部健存，且無異常反應，到期時每隻小鼠體重應增加，供試品判爲合格。如不符合上述要求，可用10只小鼠複試1次，判定標準同前。

7.1.2 （2）豚鼠試驗法

除另有規定外，每批供試品用2只豚鼠，注射前每隻豚鼠稱體重，應爲250～350g。每隻豚鼠腹腔注射供試品5.0ml，觀察7天。觀察期內，豚鼠應全部健存，且無異常反應，到期時每隻豚鼠體重應增加，供試品判爲合格。如不符合上述要求，可用4只豚鼠複試1次，判定標準同前。

8 附錄Ⅻ G 微生物限度檢查法

微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌製劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查。

微生物限度檢查應在環境潔淨度10000級下的局部潔淨度100級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。

供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。

除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度爲30～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度爲23～28℃。

檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml或10cm²爲單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。

8.1 檢驗量

檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm²）。除另有規定外，一般供試品的檢驗量爲10g或10ml;膜劑爲100cm²；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml（其中10g或10ml用於陽性對照試驗）。

檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少於4片。

一般應隨機抽取不少於檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量供試品。

8.2 供試液的製備

根據供試品的理化特性與生物學特性，採取適宜的方法製備供試液。供試液製備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃。供試液從製備至加入檢驗用培養基，不得超過1小時。

除另有規定外，常用的供試液製備方法如下。

8.2.1 1．液體供試品

取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液至100ml，混勻，作爲1: 10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作爲供試液。

8.2.2 2．固體、半固體或黏稠性供試品

取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，一作爲1：10的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。

8.2.3 3．需用特殊方法製備供試液的供試品

8.2.3.1 （1）非水溶性供試品

方法1  取供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作爲1: 20的供試液。

方法2  取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（製法見2010年版藥典三部附錄Ⅻ A 無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下）和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然後加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液100ml，振搖5～10分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作爲1:10的供試液。

8.2.3.2 （2）膜劑供試品

取供試品100cm²，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液100ml（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作爲1: 10的供試液。

8.2.3.3 （3）腸溶及結腸溶製劑供試品

取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩衝液（用於腸溶製劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩衝液（用於結腸溶製劑）至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作爲1: 10的供試液。

8.2.3.4 （4）氣霧劑、噴霧劑供試品

取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品開啓部位，用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔，放至室溫，並輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當於10g或10ml的供試品，再稀釋成1: 10的供試液。

8.2.3.5 （5）貼劑供試品

取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面，以避免貼劑粘貼在一起。然後將其置於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振盪至少30分鐘，製成供試液。貼劑也可採用其他適宜的方法製備成供試液。

8.2.3.6 （6）具抑菌活性的供試品

當供試品有抑菌活性時，採用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。

①培養基稀釋法  取規定量的供試液，至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養基，混勻，凝固，培養，計數。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌落數之和即爲1ml的菌落數，計算每1ml供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時，可加大增菌培養基的用量。

②離心沉澱法  取一定量的供試液，500轉/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混合。用於細菌檢查。

③薄膜過濾法  見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的“薄膜過濾法”。

④中和法  凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。

8.3 細菌、黴菌及酵母菌計數

8.3.1 計數培養基的適用性檢查

細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應檢查。

菌種  試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍乾燥菌種爲第0代），並採用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC （B） 44102]

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC（B） 26003]

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [CMCC （B）63501]

白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC （F） 98001]

黑麴黴（Aspergillus niger） [CMCC （F） 98003]

菌液製備  接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24～48小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數爲50～100CFU的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5～7天，加入3～5ml含0.05% （ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，採用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05% （ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含孢子數50～100CFU的孢子懸液。

菌液製備後若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2～8℃，可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。

適用性檢查  取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100CFU，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，混勻，凝固．置30～35℃培養48小時，計數；取白色念珠菌、黑麴黴各50～100CFU，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養72小時，計數；取白色念珠菌50～100CFU，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基，平行製備2個平皿，混勻。凝固，置23～28℃培養72小時，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。

結果判定  若被檢培養基上的菌落平均數不小於對照培養基上的菌落平均數的70%，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。

8.3.2 計數方法的驗證

當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。

驗證時，按供試液的製備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。

菌種及菌液製備  同計數培養基的適用性檢查。

驗證方法  驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

（1）試驗組  平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50～100CFU試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加入50～100CFU試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。

（2）菌液組  測定所加的試驗菌數。

（3）供試品對照組  取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

（4）稀釋劑對照組  若供試液製備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液製備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度爲每1ml供試液含50～100CFU，按試驗組的供試液製備方法和菌落計數方法測定其菌數。

結果判斷  在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數佔菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70%。若試驗組的菌數回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值佔菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%，照該供試液製備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌數回收率低於70%，應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。

表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法

若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作爲最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。

計數方法驗證時，採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麼選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。

驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。

8.3.3 供試品檢查

計數方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、黴菌及酵母藺菌數的測定。

按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液製備。用稀釋液稀釋成1：10、1：10²、1：10³等稀釋級的供試液。

8.3.3.1 1．平皿法

根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。每稀釋級每種培養基至少製備2個平板。

陰性對照試驗  取試驗用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養基，凝固，倒置培養。每種計數用的培養基各製備2個平板，均不得有菌生長。

培養和計數  除另有規定外，細菌培養3天，黴菌、酵母菌培養5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數，必要時，可適當延長培養時間至7天進行菌落計數並報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數後，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小於15，則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。

一般營養瓊脂培養基用於細菌計數；玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌及酵母菌計數；酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基用於酵母菌計數。在特殊情況下，若營養瓊脂培養基上長有黴菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌，則應分別點計黴菌和酵母菌、細菌菌落數。然後將營養瓊脂培養基上的黴菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數，與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的黴菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較，以菌落數高的培養基中的菌數爲計數結果。

含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定黴菌數，用酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數，合併計數。

菌數報告規則  細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小於300CFU、黴菌宜選取平均菌落數小於100CFU的稀釋級，作爲菌數報告（取兩位有效數字）的依據。以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、1ml或10cm²供試品中所含的菌數。

如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數小於1時，以<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。

8.3.3.2 2．薄膜過濾法

採用薄膜過濾法，濾膜孔徑應不大於0.45μm，直徑一般爲50mm，若採用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前後的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤溼濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應充分乾燥。爲發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾後，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量爲100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。

取相當於每張濾膜含1g、1ml或10cm²供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g、1ml或10cm²所含的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml進行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數方法的驗證”。沖洗後取出濾膜，菌面朝上貼於營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少製備一張濾膜。

陰性對照試驗  取試驗用的稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作，作爲陰性對照。陰性對照不得有菌生長。培養和計數  培養條件和計數方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數應不超過100CFU。

菌數報告規則  以相當於1g、1ml或10cm²供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長，以<1報告菌數（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm²供試品），或<1乘以稀釋倍數的值報告菌數。

8.3.4 控制菌檢查

8.3.4.1 控制菌檢查用培養基的適用性檢查

控制菌檢查用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應檢查。

菌種  對試驗菌種的要求同計數培養基的適用性檢查。

大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC （B） 44102]

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC （B）26003]

乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC （B） 50094]

銅綠假單胞菌（Pseudtrmonas aerugznosa）  [CMCC （B）10104]

生孢梭菌（Clostridium sporogenes） [CMCC （B）64941]

白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC （F） 98001]

菌液製備  接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24～48小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數爲10～100CFU的菌懸液。

菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2～8℃可在24小時內使用。

適用性檢查  控制菌檢查用培養基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養基的檢測項目及所用菌株見表2。

表2 控制菌檢查用培養基的促生長能力、抑制能力及指示能力檢查

液體培養基促生長能力檢查  分別接種不大於100CFU的試驗菌（表2）於被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌應生長良好。

固體培養基促生長能力檢查  取試驗菌各0.1ml（含菌數50～100CFU）分別塗布於被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特徵應一致。

培養基抑制能力檢查  接種不少於100CFU的試驗菌（表2）於被檢培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最長時間下培養，試驗菌應不得生長。

固體培養基指示能力檢查  取試驗菌各0.1ml（含菌數不大於100CFU）（表2）分別塗布於被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及時間下培養。被檢培養基上試驗菌生長的菌落大小、形態特徵、指示劑反應情況等應與對照培養基一致。

液體培養基指示能力檢查  分別接種不大於100CFU的試驗菌（表2）於被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌生長情況、指示劑反應等應與對照培養基一致。

8.3.4.2 控制菌檢查方法的驗證

當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所採用的方法適合予該產品的控制菌檢查。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新驗證。

驗證時，依各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌羣檢查法時，採用大腸埃希菌作爲驗證菌株。驗證試驗按供試液的製備和控制菌檢查法的規定及下列要求進行。

菌種及菌液製備  同控制菌檢查用培養基的適用性檢查。

驗證方法  取規定量供試液及10～100CFU試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當採用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最後一次沖洗液中，過濾後，注入增菌培養基或取出濾膜接人增菌培養基中。

結果判斷  若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液製備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。

驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。

8.3.4.3 供試品檢查

供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行。

陽性對照試驗  陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加菌量爲10～100CFU。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。

陰性對照試驗  取稀釋液10ml照相應控制菌檢查法檢查，作爲陰性對照．陰性對照應無菌生長。

（1）大腸埃希菌（Escherichia coli）  取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、10cm²），直接或處理後接種至適量（不少於100ml）的膽鹽乳糖培養基中，培養18～24小時，必要時可延長至48小時。

取上述培養物0.2ml，接種至含5ml MUG培養基的試管內，培養，於5小時、24小時在366nm紫外光下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。若管內培養物呈現熒光，爲MUG陽性；不呈現熒光，爲MUG陰性。觀察後，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液，液麪呈玫瑰紅色，爲靛基質陽性；呈試劑本色，爲靛基質陰性。本底對照應爲MUG陰性和靛基質陰性。

如MUG陽性、靛基質陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質陰性，或MUG陰性、靛基質陽性，則應取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線接種於曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上，培養18～24小時。

若平板上無菌落生長或生長的菌落與表3所列的菌落形態特徵不符，判供試品來檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3所列的菌落形態特徵相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑑定試驗，確認是否爲大腸埃希菌。

表3  大腸埃希菌菌落形態特徵

（2）大腸菌羣（Coriform）  取含適量（不少於10ml）的乳糖膽鹽發酵培養基管3支，分別加入1: 10的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1ml）、1: 100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1: 1000的供試液1ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖膽鹽發酵培養基管加入稀釋液1ml作爲陰性對照管。培養18～24小時。

乳糖膽鹽發酵管若無菌生長或有菌生長但不產酸產氣，判該管未檢出大腸菌羣；若產酸產氣，應將發酵管中的培養物分別劃線接種於曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上，培養18～24小時。

若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表4所列的菌落形態特徵不符或爲非革蘭氏陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌羣；若平板上生長的菌落與表4所列的菌落形態特徵柑符或疑似，且爲革蘭氏陰性無芽孢桿菌，應進行確證試驗。

表4 大腸菌羣菌落形態特徵

確證試驗  從上述分離平板上挑選4～5個疑似菌落，分別接種於乳糖發酵管中，培養24～48小時。若產酸產氣，判該乳糖膽鹽發酵管檢出大腸菌羣，否則判未檢出大腸菌羣。

根據大腸菌羣的檢出管數，按表5報告1g或1ml供試品中的大腸菌羣數。

表5 可能的大腸菌羣數

注：+代表檢出大腸菌羣；-代表未檢出大腸菌羣。

（3）沙門菌（Salmonella）  取供試品10g或10ml，直接或處理後接種至適量（不少於200ml）的營養肉湯培養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養18～24小時。

取上述培養物1ml，接種於10ml四硫磺酸鈉亮綠培養基中，培養18～24小時後，分別劃線接種子膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養基的平板上，培養18～24小時（必要時延長至40～48小時）。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同於表6所列的特徵，判供試品未檢出沙門菌。

若平板上生長的菌落與表6所列的菌落形態特徵相符或疑似，用接種針挑選2～3個菌落分別於三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養18～24小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應取三糖鐵瓊脂培養基斜面的培養物進行適宜的鑑定試驗，確認是否爲沙門菌。

表6 沙門菌菌落形態特徵

（4）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）  取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、10cm²），直接或處理後接種至適量（不少於100ml）的膽鹽乳糖培養基中，培養18～24小時。取上述培養物，劃線接種子溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的平板上，培養18～24小時。

銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面溼潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特徵不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態特徵相符或疑似，應挑選2～3個菌落，分別接種於營養瓊脂培養基斜面上，培養18～24小時。取斜面培養物進行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗。

氧化酶試驗  取潔淨濾紙片置於平皿內，用無菌玻棒取斜面培養物塗子濾紙片上，滴加新配製的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養物呈粉紅色並逐漸變爲紫紅色爲氧化酶試驗陽性，否則爲陰性。

若斜面培養物爲非革蘭氏陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。

綠膿菌素（Pyocyanin）試驗  取斜面培養物接種於PDP瓊脂培養基斜面上，培養24小時，加三氯甲烷3～5ml至培養管中，攪碎培養基並充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約1ml，振搖後，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，爲綠膿菌素試驗陽性，否則爲陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。

若上述疑似菌爲革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌爲革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續進行適宜的鑑定試驗，確認是否爲銅綠假單胞菌。

（5）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）  取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、10cm²），直接或處理後接種至適量（不少於100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養肉湯）培養基中，培養18～24小時，必要時可延長至48小時。取上述培養物，劃線接種於卵黃氯化鈉瓊脂培養基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上，培養24～72小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同於表7所列特徵，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

表7  金黃色葡萄球菌菌落形態特徵

若平板上生長的菌落與表7所列的菌落特徵相符或疑似，應挑選2～3個菌落，分別接種於營養瓊脂培養基斜面上，培養18～24小時。取營養瓊脂培養基的培養物進行革蘭氏染色，並接種於營養肉湯培養基中，培養18～24小時，做血漿凝固酶試驗。

血漿凝固酶試驗  取滅菌小試管3支，各加入血漿和無菌水混合液（1：1）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營養肉湯培養物（或由營養瓊脂培養基斜面培養物製備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養肉湯培養物（或由營養瓊脂培養基斜面培養物製備的濃菌懸液）0.5 ml、營養肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml．即爲試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養，3小時後開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應流動自如，陽性對照管血漿應凝固，若試驗管血漿凝固爲血漿凝固酶試驗陽性，否則爲陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規定時，應另製備血漿，重新試驗。

若上述疑似菌爲非革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

（6）梭菌（Clostridium）  取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、10cm²）2份，其中1份置80℃保溫10分鐘後迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理後分別接種至100ml的梭菌增菌培養基中。置厭氧條件下培養48小時。取上述每一培養物0.2ml．分別塗抹接種於含慶大黴素的哥倫比皿瓊脂培養基平板上，置厭氧條件下培養48～72小時。若平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長，應挑選2～3個菌落分別進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。

過氧化氧酶試驗  取上述平板上的菌落，置潔淨玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，爲過氧化氫酶試驗陽性，否則爲陰性。

若上述可疑菌落爲革蘭氏陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧化氫酶試驗陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。

（7） 白色念珠菌（Candida albicans）  取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、10cm²）直接或處理後接種至適量（不少於100ml）的沙氏葡萄糖液體培養基中，培養48～72小時。取上述培養物劃線接種於沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，培養24～48小時（必要時延長至72小時）。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特徵不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態特徵相符或疑似，應挑選2～3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養基平板上，培養24～48小時（必要時延長至72小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長．判供試品未檢出白色念珠菌。

若平板上生長的菌落爲綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種於1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上，培養24～48小時。取培養物進行染色、鏡檢及芽管試驗。芽管試驗  挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上的培養物，接種於加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置溼潤的平皿內，於35～37℃培養1～3小時，置顯微鏡下觀察孢子上有否長出短小芽管。

若上述疑似菌爲非革蘭氏陽性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。

8.4 結果判斷

供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果爲準，不再複試。

供試品的細菌數、黴菌和酵母菌數其中任何一項不符合該品種項下的規定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立複試兩次，以3次結果的平均值報告菌數。

若供試品的細菌數、黴菌和酵母菌數及控制菌三項檢驗結果均符合該品種項下的規定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品不符合規定。

8.5 稀釋液

稀釋液配製後，應採用驗證合格的滅菌程序滅菌。

1．pH7,0無菌氯化鈉－蛋白腖緩衝液

照無菌檢查法（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）製備。

2．pH6.8無菌磷酸鹽緩衝液、pH7.6無菌磷酸鹽緩衝液

按緩衝液（2010年版藥典二部附錄XV D）配製後，過濾，分裝，滅菌。

如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌後加入表面活性劑或中和劑等。

3. 0.9%無菌氯化鈉溶液

取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。

8.6 培養基及其製備方法

培養基可按以下處方製備，也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配製後，應採用驗證合格的滅菌程序滅菌。

1．營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基及改良馬丁瓊脂培養基

照無菌檢查法（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）製備。

2．玫瑰紅鈉瓊脂培養基

腖 5.0g

玫瑰紅鈉 0.0133g

葡萄糖 10.0g

瓊脂 14.0g

磷酸二氫鉀 1.0g

水 1000m1

硫酸鎂    1.5g

除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝，滅菌。

3．酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基（YPD）

腖10.0g

瓊脂14.0g

酵母浸出粉 5.0g

水1000ml

葡萄糖 20.0g

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加人葡萄糖，分裝，滅菌。

4．膽鹽乳糖培養基（BL）

腖 20.0g

磷酸二氫鉀 1.3g

乳糖 5.0g

氯化鈉 5.0g

牛膽鹽 2.0g（或去氧膽酸鈉）  （0.5g）

磷酸氫二鉀 4.0g

水1000ml

除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.4±0.2，煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。

5．乳糖膽鹽發酵培養基

腖 20.0g

0.04%溴甲酚紫指示液25ml

乳糖 10.0g

水 1000ml

牛膽鹽 5.0g

除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.4±0.2，加入0.04%溴甲酚紫指示液，根據要求的用量分裝於含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規格應保證產氣結果的觀察。

6．曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB）

營養瓊脂培養基 100ml

曙紅鈉指示液 2ml

20%乳糖溶液 5ml

亞甲藍指示液1.3～1.6ml

取營養瓊脂培養基，加熱溶化後，冷至60C，按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿。

7．麥康凱瓊脂培養基（MacC）

腖 20.0g

1%中性紅指示液 3ml

乳糖 10.0g

瓊脂 14.0g

牛膽鹽 5.0g

水 1000ml

氯化鈉 5.0g

除乳糖、1%中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60℃，傾注平皿。

8. 4-甲基傘形酮葡糖苷酸 （4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）培養基

腖 10.0g

磷酸二氫鉀（無水） 0.9g

硫酸錳 0.5mg

磷酸氫二鈉（無水）6.2g

硫酸鋅0. 5mg

亞硫酸鈉40mg

硫酸鎂0.1

去氧膽酸鈉1.0g

氯化鈉5.0g

MUG 75mg

氯化鈣50mg

水1000ml

除MUG外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分裝5ml，滅菌。

9．三糖鐵瓊脂培養基（TSI）

腖 20.0g

硫酸亞鐵0.2g

牛肉浸出粉5.0g

硫代硫酸鈉 0.2g

乳糖10.0g

0.2%酚磺酞指示液12.5ml

蔗糖10.0g

瓊脂12.0g

葡萄糖1.0g

水1000ml

氯化鈉5.0g

除三種糖、0.2%酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.3±0.1，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，分裝，滅菌，製成高底層（2～3cm）短斜面。

10．四硫磺酸鈉亮綠培養基 （TTB）

腖 5.0g

硫代硫酸鈉 30.0g

牛膽鹽 1.0g

水 1000ml碳酸鈣 10.0g

取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。

臨用前，取上述培養基，每10ml加入碘試液0.2ml和亮綠試液0.1ml，混勻。

11. 沙門、志賀菌屬瓊脂培養基（SS）

腖 5.0g

硫代硫酸鈉 8.5g

牛肉浸出粉 5.0g

中性紅指示液 2.5ml

乳糖 10.0g

亮綠試液 0.33ml

牛膽鹽 8.5g

瓊脂 16.0g

枸櫞酸鈉 8.5g

水1000ml

枸櫞酸鐵銨1.0g

除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.2±0.1，濾過，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。

12．膽鹽硫乳瓊脂培養基（DHL）

腖 20.0g

枸櫞酸鈉 1.0g

牛肉浸出粉 3.0g

枸櫞酸鐵銨 1.0g

乳糖 10.0g

中性紅指示液 3ml

蔗糖 10.0g

瓊脂 16.0g

去氧膽酸鈉 1.0g

水 1000ml

硫代硫酸鈉 2.3g

除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.2±0.1，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘成分，搖勻，冷至60℃，傾注平皿。

13. 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基

腖 10.0g

溴化十六烷基三甲銨0.3g

牛肉浸出粉 3.0g

瓊脂 14.0g

氯化鈉 5.0g

水 1000ml

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.5±0.1，加入瓊脂，加熱溶化後，分裝，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。

14. 亞碲酸鹽肉湯培養基

臨用前，取滅菌的營養肉湯培養基，每100ml中加入新配製的1%亞碲酸鈉（鉀）試液0.2ml，混勻，即得。

15．卵黃氯化鈉瓊脂培養基

腖 6.0g

10%氯化鈉卵黃液100ml

牛肉浸出粉 1.8g

瓊脂 14.0g

氯化鈉 30.0g

水 650ml

除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.6±0.1，滅菌，待冷至約60℃，以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。

10%氯化鈉卵黃液的製備  取新鮮雞蛋1個，以無菌操作取出卵黃，放入10%無菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。

16．甘露醇氯化鈉瓊脂培養基

腖 10.0g

酚磺酞指示液 2.5ml

牛肉浸出粉 1.0g

瓊脂 14.0g

甘露醇 10.0g

水 1000ml

氯化鈉 75.0g

除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.4±0.2，加入瓊脂，加熱溶化後，濾過，分裝，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。

17．乳糖發酵培養基

腖 20.0g

乳糖 10.0g

0.04%溴甲酚紫指示液 25ml

水 1000ml

除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.2±0.2，加入指示液，分裝於含倒管的小試管中，每管3ml。滅菌。

18．綠膿菌素（Pyocyanin）測定用培養基（PDP瓊脂培養基）

腖 20.0g

甘油 10ml

氯化鎂（無水） 1.4g

瓊脂 14.0g

硫酸鉀（無水） 10.0g

水 1000ml

取腖、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝於試管，滅菌，置成斜面。

19．梭菌增菌培養基

牛肉浸出粉 10.0g

鹽酸半胱氨酸 0.5g

腖 10.0g

氯化鈉 5.0g

酵母浸出粉 3.0g

醋酸鈉 3.0g

可溶性澱粉 1.0g

瓊脂 0.5g

葡萄糖 5.0g

水 1000ml

取上述成分，混合，加熱煮沸使溶解，調節pH值使滅菌後爲6.8±0.2，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌。

20．哥倫比亞瓊脂培養基

酪蛋白胰酶消化物 10.0g

肉胃酶消化物 5.0g

心胰酶消化物 3.0g

酵母浸出粉 5.0g

玉米澱粉 1.0g

氯化鈉 5.0g

瓊脂 15.0g

水 1000ml

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後爲7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌，冷至45～50℃，加入相當於20mg慶大黴素的無菌硫酸慶大黴素，混勻，傾注平皿。

21.沙氏葡萄糖液體培養基

腖 10g

葡萄糖 40g

水 1000ml

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過。加入葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。

22．沙氏葡萄糖瓊脂培養基

腖 10g

水 1000ml

葡萄糖 40g

瓊脂 14g

除瓊脂和葡萄糖外，混合，微溫溶解，濾過。加入瓊脂和葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。

23．（科瑪嘉）念珠菌顯色培養基①

腖 10.2g

瓊脂 15g

氫罌素 0.5g

滅菌水 1000ml

色素 22.0g

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值至6.3±0.2。濾過，加入瓊脂，加熱煮沸，不斷攪拌至瓊脂完全溶解，傾注平皿。

24. 1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基

黃色玉米粉 40g

瓊脂 10～15g

聚山梨酯80 10ml

水 1000ml

取玉米粉、聚山梨酯80及蒸餾水500ml，混合，65℃加熱30分鐘，混勻，用紗布濾過，補足原水量。取瓊脂，水500ml，混合，加熱溶解。將以上兩種溶液混合，搖勻，分裝，滅菌。

8.7 微生物限度標準

非無菌藥品的微生物限度標準是基於藥品的給藥途徑及對患者健康潛在的危害而制訂的。藥品的生產、貯存、銷售過程中的檢驗，原料及輔料的檢驗，新藥標準制訂，進口藥品標準複覈，考察藥品質量及仲裁等，除另有規定外，其微生物限度均以本標準爲依據。

1．製劑通則、品種項下要求無菌的製劑及標示無菌的製劑  應符合無菌檢查法規定。

2．口服給藥製劑

細菌數  每1g不得過1000CFU。每1ml不得過100CFU。

黴菌和酵母菌數  每1g或1ml不得過100CFU。

①本檢查法中白色念珠菌檢查所描述該菌在唸珠菌顯色培養基上的菌落特徵，是指該菌在法國科瑪嘉公司提供的科瑪嘉念珠菌顯色培養基上生長的菌落特徵。給出這一信息是爲了方便本方法的使用者，並不表示對該公司產品的認可。若其他等效產品具有相同的效果，那麼也可使用其他等效的產品。

大腸埃希菌  每1g或1ml不得檢出。

3．局部給藥製劑

3.1  用於手術、燒傷及嚴重創傷的局部給藥製劑應符合無菌檢查法規定。

3.2   耳、鼻及呼吸道吸入給藥製劑

細菌數  每1g、1ml或10cm²不得過100CFU。

黴菌和酵母菌數  每1g、1ml或10cm²不得過10CFU。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌  每1g、1ml或10cm²不得檢出。

大腸埃希菌  鼻及呼吸道給藥的製劑，每1g、1ml或10cm²不得檢出。

3.3  陰道、尿道給藥製劑

細菌數  每1g、1ml或10cm²不得過100CFU。

黴菌數和酵母菌數  每1g、1ml或10cm²應小於10CFU。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌  每1g、1ml或10cm²不得檢出。

3.4  直腸給藥製劑

細菌數  每1g不得過1000CFU。每1ml不得過100CFU。

黴菌和酵母菌數  每1g或1ml不得過100CFU。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌  每1g或1ml不得檢出。

3.5  其他局部給藥製劑

細菌數  每1g、1ml或10cm²不得過100CFU。

黴菌和酵母菌數  每1g、1ml或10cm²不得過100CFU。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌  每1g、1ml或10cm²不得檢出。

4．含動物組織（包括提取物）的口服給藥製劑  每10g或10ml還不得檢出沙門菌。

5．有兼用途徑的製劑  應符合各給藥途徑的標準。

6．黴變、長蟎者  以不合格論。

7．原料及輔料  參照相應制劑的微生物限度標準執行。

9 附錄Ⅻ H 鼠源性病毒檢查法

鼠源性單克隆抗體製品具有潛在病毒污染，如出血熱病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、Ⅲ型呼腸孤病毒、仙台病毒、脫腳病病毒、小鼠腺病毒、小鼠肺炎病毒、逆轉錄病毒等。其中前4種病毒屬Ⅰ組，爲能夠感染人與靈長類動物的病毒；後4種屬Ⅱ組，爲目前尚無跡象表明感染人的病毒，但能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行複製，對人類具有潛在危險性，這些病毒應作爲重點進行檢測。

本法用於雜交瘤細胞株及鼠源性單克隆抗體製品的鼠源性病毒檢測。通過細胞試驗、動物抗體產生試驗、雞胚感染試驗等檢測活病毒抗原及病毒抗體。

9.1 試劑

（1） 0.01mol/L pH7.4 PBS  稱取磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄·12H₂O）2.9g、磷酸二氫鈉0.2g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.2g，加水溶解並稀釋至1000ml。

（2） pH9.6包被緩衝液  稱取碳酸鈉1.59g、碳酸氫鈉2.93g、疊氮鈉0.20g，加水溶解並稀釋至1000ml。

（3）0.01mol/L pH7.4 PBS洗液  稱取磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄·12H₂O）2.9g、磷酸二氫鈉0.295g、氯化鈉8.5g、聚山梨酯80 5ml，加水溶解並稀釋至1000ml。

（4）底物緩衝液  稱取磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄·12H₂O）  12.9g、枸櫞酸3.26g，加水溶解並稀釋至700ml。

（5）底物溶液  稱取鄰苯二胺4mg，溶於底物緩衝液10ml中，再加入30%過氧化氫4μl。

（6）終止液  1mol/L硫酸溶液。

9.2 供試品的製備

供試品包括雜交瘤細胞株、腹水和單克隆抗體半成品或成品。雜交瘤細胞株應進行細胞試驗、動物抗體產生試驗和雞胚感染試驗；腹水和單克隆抗體半成品或成品應進行動物抗體產生試驗和雞胚感染試驗。

（1）細胞試驗用的供試品  取3瓶生長良好的雜交瘤細胞，於-40℃反覆凍融3次後，在無菌條件下合併分裝小管，每管3ml，換上膠塞，-40℃保存。

（2）動物抗體產生試驗用的供試品  單克隆抗體腹水、半成品或成品，不需處理，-20℃保存。而雜交瘤細胞按下述步驟進行處理後使用。

取7瓶生長良好的雜交瘤細胞，棄去培養液，用PBS輕輕將細胞吹打下來，移入小管，再用PBS沖洗細胞瓶，以收集殘餘的細胞。於小管中洗滌，以每分鐘1000轉離心10分鐘，棄去上清液，用PBS重新懸浮細胞，以上步驟重複2次。細胞集中後，懸浮於4ml PBS中，凍融3次，超聲處理。以每分鐘10000轉離心30分鐘，吸取上清液，以每分鐘40000轉離心4小時，棄上清液，將沉澱溶於適量的PBS中，即爲動物抗體產生試驗用抗原。-40℃保存。

9.3 檢查法

檢查方法包括細胞試驗、動物抗體產生試驗、雞胚感染試驗等。

9.3.1 1．細胞試驗

用已知病毒抗體檢查供試品中未知病毒抗原。

（1）細胞培養  根據被檢的病毒，選擇其敏感的細胞。每種細胞6瓶，細胞應生長良好。用0.01mol/LpH7.4 PBS洗細胞2次。每瓶接種供試品0.3ml，每批供試品接種4瓶，另外2瓶爲對照。37℃吸附1小時，棄去吸附的供試品液體，加入細胞維持液。每天觀察細胞形態，並記錄結果。接種後每隔3～4天換1次液。第1代細胞應維持10～14天。凍融3次後，將對照組2瓶、供試品組4瓶分別合併。將收穫的對照組和供試品組的細胞懸液分別接種同種細胞，接種後，每隔3～4天，換1次液。

（2）塗片  培養至10～14天，吸出維持液，再用PBS洗細胞2次，每瓶加消化液0.15ml，使細胞分散、脫壁，吸出細胞懸液，再用PBS洗滌2次。用適量的PBS懸浮細胞，將對照組的正常細胞塗在抗原片的第1行，供試品組的細胞塗在第2行，吹乾，丙酮固定，-40℃保存，即爲供試品細胞塗片。

（3）間接免疫熒光法檢測  製備已知病毒抗原片，將已知特異性陽性血清和陰性血清進行1: 5～1：20的稀釋；應用製備的已知病毒抗原片作爲血清對照，檢查供試品細胞塗片。將塗有供試品細胞的玻片，加經PBS 10倍稀釋的已知陽性血清、陰性血清，置溼盒中，37℃放置30分鐘後，用PBS洗滌3次，每次浸泡5分鐘，待乾燥後，滴加熒光抗體，37℃保溫30分鐘後，用PBS洗滌3次，每次浸泡5分鐘，再用水洗1次，待乾燥後，加50%甘油，用蓋玻片封好，鏡檢。

（4）結果判定  在已知病毒抗原片上，陰性對照血清與正常細胞孔、病毒細胞孔無熒光，陽性對照血清與正常細胞孔無熒光，與病毒細胞孔有熒光；在供試品細胞塗片上，陰性對照血清與正常細胞孔、供試品細胞孔無熒光，陽性對照血清與正常細胞孔無熒光時，試驗成立。陰性對照血清與正常細胞孔和供試品細胞孔有熒光反應或陽性對照血清與正常細胞孔有熒光反應，試驗不成立。供試品細胞塗片上，陽性對照血清與供試品細胞孔有熒光，判爲陽性。

9.3.2 2．動物抗體產生試驗

（l）供試品抗體的製備  每批供試品按下表參數注射無特定病原體小鼠（BALB/C或KM）共50只。

（2）血清學檢查  對經肌內注射和腹腔注射的供試品組和對照組小鼠分別採血，分離血清後用ELISA法檢測抗體。包被病毒抗原和正常細胞抗原，每孔0.1ml，置37℃、1小時後，放4℃過夜，用洗液充分洗滌，拍幹。每份供試品分別加入病毒抗原孔和正常細胞抗原孔各1個，37℃培養1小時，用洗液充分洗滌，拍幹。加酶結合物，37℃培養1小時，用洗液充分洗滌，拍幹。每孔加入底物溶液0.1ml，37℃培養10～20分鐘，當陽性血清對照孔出現顏色，陰性對照孔無顏色時，每孔加入1mol/L硫酸溶液0.1ml終止反應，測吸光度。

（3）結果判定  P/N值不小於2.1爲陽性；

P/N值在1.5～2.0爲可疑；

P/N值小於1.5爲陰性。

P爲供試品免疫小鼠血清與病毒抗原的吸光度減去供試品免疫小鼠血清與正常細胞抗原的吸光度；

N爲對照組動物血清與病毒抗原的吸光度減去對照組動物血清與正常細胞抗原的吸光度。

9.3.3 3．雞胚感染試驗

於接種前24小時觀察雞胚。活雞胚具有清晰的血管和雞胚暗影，較大雞胚還可看到胚動。死胚血管暗昏模糊，沒有胚動。接種前用檢卵燈再次檢查雞胚活力，並標出氣室和胚胎的位置。按無菌操作要求，以卵黃囊、尿囊腔和絨毛尿囊膜途徑接種供試品。接種後，每日觀察，培養5天。無菌操作收集卵黃囊、絨毛尿囊膜和尿囊液。卵黃囊和絨毛尿囊膜經研磨後，離心，取上清液，與尿囊液分別用豚鼠或雞紅細胞做血凝試驗。

取每排8孔微量血凝反應板，從第2孔至第8孔每孔加生理氯化鈉溶液50μl。第1、2孔各加經上述處理的供試品50μl，然後從第2孔吸取50μl至第3孔，第3孔吸取50μl至第4孔（以此類推）進行倍比稀釋，至第7孔時丟棄50μl。第8孔爲對照孔。第1孔至第8孔各加1%；豚鼠紅細胞懸液50μl，混勻。做2塊反應板，分別靜置於4℃和室溫，至對照孔呈現明顯陰性時判定結果。

結果判定：

++++  紅細胞均勻鋪於孔底；

+++  紅細胞均勻鋪於孔底，但邊緣不整齊，有下滑趨向；

++  紅細胞於孔底形成小環，但周圍有小凝集塊；

+  紅細胞於孔底形成小團，邊緣可見少許凝集塊；

-  紅細胞集中在孔底中央，呈一邊緣緻密的紅點；

以凝集反應出現“++”，或“++”以上者判爲陽性。

10 參考資料

1. ^ [1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：2010年版：第二增補本[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010．