2 附錄XVII A 抑菌劑(防腐劑)效力檢查法指導原則
抑菌劑(防腐劑)效力檢查法系用於測定滅菌、非滅菌製劑中抑菌劑的活性,以評價最終產品的抑菌效力,同時也可用於指導生產企業在研發階段製劑中抑菌劑濃度的確定。如果藥物本身不具有充分的抗菌活性,那麼應根據製劑特性(如水溶液製劑)添加適宜的抑菌劑,以防止製劑在正常貯藏和使用過程中可能發生的微生物污染和繁殖使藥物發生變質而對使用者造成危害,尤其是多劑量包裝的製劑。在藥品生產過程中,抑菌劑不能用於替代藥品生產的GMP管理,不能作爲非滅菌製劑降低微生物污染的唯一途徑,也不能作爲控制多劑量包裝製劑滅菌前的生物負載的手段。所有抑菌劑都具有一定的毒性,製劑中抑菌劑的量應爲最低有效量。同時,爲保證用藥安全,最終包裝容器中的抑菌劑有效濃度應低於對人體有害的濃度。
在製劑通則中要求具有擾菌活性的製劑,不管是添加的抑菌劑,還是藥物本身具有抗菌活性,在藥物研發階段,均應確認其抗菌效力。抑菌劑的抗菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而提高或降低,因此,應驗證最終容器中的抑菌劑效力在有效期內不因貯藏條件而降低。
本試驗方法和抑菌劑抑菌效力判斷標準用於包裝未啓開的成品製劑。
2.1 產品分類
進行本試驗的藥品分爲四類(表1),以便標準的制定和執行。
2.2 培養基
2.2.1 培養基的製備
酪蛋白腖 17.0g
磷酸二氫鉀 2.5g
氯化鈉 5.0g
葡萄糖 2.5g
水 1000ml
除葡萄糖外,取上述成分混合,微溫溶解,調pH值約7.0,煮沸,加入葡萄糖溶解後,搖勻,濾清,調節pH值使滅菌後爲7.3±0.2,分裝,滅菌。
除上述胰酪腖大豆肉湯培養基的處方和製法,加入14.0g瓊脂,凋pH值使滅菌後爲7.3±0.2,分裝,滅菌。
3.沙氏葡萄糖液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基照微生物限度檢查法(2010年版藥典三部附錄Ⅻ G)製備。
2.2.2 培養基的適用性檢查
抑菌劑效力測定用培養基應進行培養基的適用性檢查,包括成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應檢查。
2.2.2.1 菌種
試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的冷凍乾燥菌種爲第0代),並採用適宜的菌種保藏技術進行保存,以保證試驗菌株的生物學特性。
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]
大腸埃希菌(Escherichia coli) [CMCC (B) 44102]
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]
白色念珠菌(Candida aibicans) [CMCC (F)98001]
黑麴黴(Aspergillus niger) [CMCC (F) 98003]
2.2.2.2 菌液製備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至胰酪腖大豆肉湯培養基中,30~35℃培養18~24小時;接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中,20~25℃培養24~48小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數爲50~100CFU的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基中.20~25℃培養5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然後,採用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含孢子數50~100CFU的孢子懸液。
菌液製備後若在室溫下放置,應在2小時內使用;若保存在2~8℃,可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2~8℃,在驗證過的貯存期內使用。
2.2.2.3 適用性檢查
取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各50~100CFU.分別注入無菌平皿中,立即傾注胰酪腖大豆瓊脂培養基,每株試驗菌平行製備2個平皿,混勻,凝固,置30~35℃培養48小時,計數;取白色念珠菌、黑麴黴各50~100CFU,分別注入無菌平皿中,立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基,每株試驗菌平行製備2個平皿,混勻,凝固,置20~25℃培養72小時,計數;同時,用對應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。
2.2.2.4 結果判定
若被檢培養基上的菌落平均數不小於對照培養基上菌落平均數的70%,且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致,判該培養基的適用性檢查符合規定。
2.3 抑菌劑效力測定
2.3.1 菌種
同培養基的適用性檢查,若需要,製劑中常見的污染微生物也可作爲試驗菌株。
2.3.2 菌液製備
接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的新鮮培養物至胰酪腖大豆肉湯培養基或胰酪腖大豆瓊脂培養基中,30~35℃培養18~24小時;接種白色念珠菌於沙氏葡萄糖液體培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基中,20~25℃培養24~48小時。若爲瓊脂培養物,加入適量的0.9%無菌氯化鈉溶液將瓊脂表面的培養物洗脫,然後,用適宜方法吸出菌懸液至無菌試管內,加入適量的0.9%無菌氯化鈉溶液並採用比濁法製成每1ml含菌數約爲108 CFU的菌懸液。若爲液體培養物,用離心法收集菌體,並用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗,採用比濁法製成每1ml含菌數約爲108 CFU的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂培養基中,23~28℃培養5~7天,加入3~5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,然後,用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,加入適量的含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液並採用比濁法製成每1ml含孢子數108 CFU的孢子懸液。同時採用平皿法測定1ml菌懸液的菌數。
菌液製備後若在室溫下放置,應在2小時內使用;若保存在2~8℃,可在24小時內使用。黑麴黴的孢子懸液可保存在2~8℃,在1周內使用。
2.3.3 供試品接種
抑菌劑效力可能受試驗用容器特徵的影響,如容器的材質、形狀、體積及封口的方式等。因此,只要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用,同時容器便於按無菌操作技術接入試驗菌液、混合及取樣等,一般應將試驗菌直接接種於供試品原包裝容器中進行貯存。若因供試品的性狀或每個容器裝量等因素需將供試品轉移至無菌容器時,該容器的材質不得影響供試品的特性(如吸附作用),特別應注意不得影響供試品的pH,pH對抑菌劑的活性影響很大,同時容器的口徑大小應便於供試品的進出及混勻。
取包裝完整的供試品至少5份,直接接種試驗菌,或取適量供試品分別轉移至5個適宜的無菌容器中(若試驗菌株數超過5株,應增加相應的供試品份數),每一容器接種一種試驗菌,1、2、3類供試品中1g或1ml接種菌量爲105~106 CFU,4類供試品中1g或1ml接種菌量爲103~104CFU,接種菌液的體積不得超過供試品體積的0.5%~1%,充分混合,使供試品中的斌驗菌均勻分佈。然後將接種的供試品在試驗期間置20~25℃,避光貯存,貯存溫度的變化應儘可能控制在最小範圍,並防止被污染。
2.3.4 存活菌數測定
根據產品類型,在供試品剛接種(0時)及表2規定的間隔時間,分別從上述每個容器中取供試品1ml (g),用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液稀釋成1: 10、1:102、1: 103等稀釋級。採用平皿法或薄膜過濾法(照2010年版藥典三部附錄Ⅻ G 微生物限度檢查法,其中測定細菌用胰酪腖大豆瓊脂培養基,測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養基)測定每份供試品中所含的菌數。菌數測定方法應進行驗證,驗證方法按微生物限度檢查法(2010年版藥典三部附錄Ⅻ G)中的“計數方法的驗證”進行,其中測定細菌用胰酪腖大豆瓊脂培養基,測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養基。
根據菌數測定結果,計算1ml (g)供試品各試驗菌所加的菌數及各間隔時間的菌數,並換算成lg值。
2.3.5 結果判斷
抑菌劑效力根據各間隔時間的菌數lg值相對於初始值(0時菌數lg值)減少程度進行評價(表2),試驗結果按有效數字的修約規則進舍,保留小數點後1位有效數字。結果符合表2要求可判定該產品抑菌效力符合規定。
2類供試品
3類供試品
4類供試品
注:表中“不增加”是指對前一個測定時間,試驗菌增加的數量不超過0.5lg。
3 附錄XVII B 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則
本指導原則是爲所採用的試驗方法能否替代藥典規定的方法用於藥品微生物的檢驗提供指導。
隨着微生物學的迅速發展,製藥領域不斷引入了一些新的微生物檢驗技術,大體可分爲三類:(1)基於微生物生長信息的檢驗技術,如生物發光技術、電化學技術、比濁法等;(2)直接測定被測介質中活微生物的檢驗技術,如同相細胞技術法、流式細胞計數法等;(3)基於微生物細胞所含有特定組成成分的分析技術,如脂肪酸測定技術、核酸擴增技術、基因指紋分析技術等。這些方法與傳統檢查方法比較,或簡便快速,或具有實時或近實時監控的潛力,使生產早期採取糾正措施及監控和指導優良生產成爲可能,同時新技術的使用也促進了生產成本降低及檢驗水平的提高。
在控制藥品微生物質量中,微生物實驗室出於各種原因如成本、生產量、快速簡便及提高藥品質量等需要而採用非藥典規定的檢驗方法(即替代方法)時,應進行替代方法的驗證,確認其應用效果優於或等同於藥典的方法。
3.1 微生物檢驗的類型及驗證參數
藥品微生物檢驗方法主要分兩種類型:定性試驗和定量試驗。定性試驗就是測定樣品中是否存在活的微生物,如無菌檢查及控制菌檢查。定量試驗就是測定樣品中存在的微生物數量,如菌落計數試驗。
由於生物試驗的特殊性,如微生物檢驗方法中的抽樣誤差、稀釋誤差、操作誤差、培養誤差和計數誤差都會對檢驗結果造成影響,因此,藥品質量標準分析方法驗證指導原則(2010年版藥典二部附錄XIX A)不完全適宜於微生物替代方法的驗證。藥品微生物檢驗替代方法的驗證參數見表1。
儘管替代方法的驗證參數與藥品質量標準分析方法驗證參數有相似之處,但是其具體的內容是依據微生物檢驗特點而沒立的。替代方法驗證的實驗結果需進行統計分析,當替代方法屬於定性檢驗時,一般採用非參數的統計技術;當替代方法屬於定量檢驗時,需要採用參數統計技術。
進行微生物替代方法的驗證時,若替代方法只是針對藥典方法中的某一環節進行技術修改,此時,需要驗證的對象僅是該項替代技術而不是整個檢驗方法。如無菌試驗若改爲使用含培養基的過濾器,然後通過適宜的技術確認活的微生物存在,那麼,驗證時僅需驗證所用的微生物回收系統而不是整個無菌試驗方法。
3.2 替代方法驗證的一般要求
在開展替代方法對樣品檢驗的適用性驗證前,有必要對替代方法有一個全面的瞭解。首先,所選用的替代方法應具備必要的方法適用性證據,表明在不含樣品的情況下,替代方法在不同類型的微生物檢驗中所具有的專屬性、精密度和檢測限等參數。這些證據或由替代方法的研發者提供,或由方法使用者完成。
使用者在基本確認替代方法的適用性後,應採用樣品按表1規定的參數逐一進行驗證,以確認替代方法可否用於該樣品的檢驗。驗證至少使用2個批號的樣品,每批樣品應平行進行至少3次獨立實驗。
在開展各參數驗證時,涉及的菌種除應包括微生物限度檢查法(2010年版藥典三部附錄Ⅻ G)和無菌檢查法(2010年版藥典三部附錄Ⅻ A)中培養基適用性檢查規定的菌株外,還應根據替代方法及樣品的特點增加相應的菌株。各菌種應分別進行驗證。
3.3 樣品中微生物定性檢驗方法的驗證
3.3.1 1.專屬性
微生物定性檢驗的專屬性是指檢測樣品中可能存在的特定微生物種類的能力。當替代方法以微生物生長作爲判斷微生物是否存在時,其專屬性驗證應確認所用培養基的促生長試驗,還應考慮樣品的存在對檢驗結果的影響。當替代方法不是以微生物生長作爲判斷指標時,其專屬性驗證應確認檢測系統中的外來成分不得干擾試驗而影響結果,如確認樣品的存在不會對檢驗結果造成影響。採用替代方法進行控制菌的檢驗,還應選擇與控制菌具有類似特性的菌株作爲驗證對象。
3.3.2 2.檢測限
微生物定性檢驗的檢測限是指在替代方法設定的檢驗條件下,樣品中能被檢出的微生物的最低數量。南於微生物所具有的特殊性質,檢測限是指在稀釋或培養之前初始樣品所含有的微生物數量,而不是指檢驗過程中某一環節的供試液中所含有的微生物數量。例如,微生物限度檢查中規定不得檢出沙門菌,對檢測限而言,是指每10g樣品中能被檢出的沙門菌的最低數量。
檢測限確定的方法是在樣品中接種較低濃度的試驗茵(每單位不超過5CFU),然後分別採用藥典方法和替代方法對該試驗菌進行檢驗,以檢出與否來比較兩種方法的差異。試驗菌的接種量鬚根據試驗而定,以接種後採用藥典方法50%的樣品可檢出該試驗菌爲宜。檢測限驗證至少應重複進行5次。對於同一種試驗菌可採用卡方檢驗(X2)來評價兩種方法的檢測限是否存在差異。
3.3.3 3.重現性
微生物定性檢驗的重現性是指相同的樣品在正常的實驗條件(如實驗地點、實驗人員、儀器、試劑的批次等)發生變化時,所得檢驗結果的精密度。重現性可視爲微生物檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環境變化的能力。方法使用者應優先測定該驗證參數。在樣品中接種一定數量的試驗菌(接種量應在檢測限以上),採用藥典方法和替代方法,分別由不同人員,在不同時間,使用不同的試劑(或儀器)進行檢驗.採用卡方檢驗(X2)來評價兩種方法的重現性是否存在差異。驗證過程中,應關注樣品的一致性。
3.3.4 4.耐用性
微生物定性檢驗的耐用性是指當方法參數有小的刻意變化時,檢驗結果不受影響的能力,爲方法正常使用時的可靠性提供依據。方法使用者應優先測定該驗證參數。與藥典方法比較,若替代方法檢驗條件較爲苛刻,則應在方法中加以說明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的,但應單獨對替代方法的耐用性進行評價,以便使用者瞭解方法的關鍵操作點。
3.4 樣品中微生物定量檢驗方法的驗證
微生物定量檢驗一般都涉及菌落計數。對計數結果進行數據處理時通常需要使用統計的方法。由於菌落計數服從泊松分佈,因此採用泊松分佈的統計方法對計數結果進行數據處理優於採用正態分佈的統計方法。檢驗者往往習慣採用正態分佈的統計方法,因此也可以通過對數轉換或平方根加1的方法將原始數據轉換爲正態分佈數據後再進行統計分析。兩種統計方法都適用於微生物數據的統計分析。
3.4.1 1.準確度
微生物定量檢驗的準確度是指替代方法的檢驗結果與藥典方法檢驗結果一致的程度。準確度的確認應在檢測的範圍內,通常用微生物的回收率(%)來表示。
檢測範圍內的準確度都應符合要求,準確度驗證的方法是:製備試驗菌的菌懸液,菌懸液的濃度應選擇爲能夠準確計數的最高濃度,然後系列稀釋至較低濃度(如小於10CFU/ml)。例如,菌落計數平皿法的替代方法,在製備高濃度菌懸液時,其濃度可以是103CFU/ml,並系列稀釋至100 CFU/ml。每個試驗菌應至少選擇5個菌濃度進行準確度確認,替代方法的檢驗結果不得少於藥典方法檢驗結果的70%,也可以採用合適的統計學方法表明替代方法的回收率至少與藥典方法一致。當替代方法的回收率高於藥典方法時,有必要結合專屬性項下的有關內容對準確度進行評價。
3.4.2 2.精密度
微生物定量檢驗的精密度是指在檢驗範圍內,對同一個均勻的樣品多次重複取樣測定,其檢驗結果的一致程度,通常採用標準偏差或相對標準偏差來表示,也可以採用其他適宜的方式。
精密度驗證的方法是:製備試驗菌的菌懸液,菌懸液的濃度應選擇爲能夠準確讀數的最高濃度,然後系列稀釋至較低濃度(如小於10CFU/ml)。每個試驗菌選擇其中至少5個濃度的菌懸液進行檢驗。每一個濃度至少應進行10次重複檢驗,以便能夠採用統計分析方法得到標準偏差或相對標準偏差。一般情況下,可以接受的相對標準偏差(RSD)應不大於35%。不考慮特殊的檢驗結果,替代方法的相對標準偏差(RSD)應不大幹藥典方法。例如,藥典菌落計數平皿法其可接受的相對標準偏差(RSD)與含菌濃度的關係見表2。
表2 不同含菌濃度下預期的相對標準偏差
CFU/皿 | 預期RSD |
<10 | <35% |
10~30 | <25% |
30~300 | <15% |
3.4.3 3.專屬性
微生物定量檢驗的專屬性是指通過檢測適宜的試驗菌,以證明檢驗方法與其設定目的相適應的能力。例如,菌落計數平皿法其設定目的在於檢出一定數量的微生物,則其專屬性驗證應證明當樣品中存在一定數量的試驗菌時,通過平皿法檢驗,能夠檢出試驗菌,而樣品的存在不會對結果造成影響。專屬性驗證時,應能夠設計出可能使替代方法出現假陽性的實驗模型來挑戰替代方法,從而確認替代方法的適用性。當替代方法不依賴微生物生長出菌落或出現混濁就可以定量時(如不需要增菌或在1~50CFU範圍內就可直接測定菌數的定量方法),以上驗證方式就顯得更爲重要。
3.4.4 4.定量限
微生物定量檢驗的定量限是指樣品中能被準確定量測定的微生物最低數量。由於無法得到含有已知微生物數量的實驗樣品,因此,在定量限驗證時,應選擇在檢驗範圍內至少5個菌濃度,每個濃度重複取樣測定不少於5次,替代方法的定量限不得大於藥典方法。需要注意的是,由於細菌計數和菌落數服從泊松分佈,可能存在計數結果的誤差,因此替代方法的定量限僅需證實在相近的低限度下其靈敏度至少相當於藥典方法。
定量限驗證的方法是:在檢驗範圍的低限制備5份不同含菌濃度的菌懸液,每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進行不少於5次檢驗,採用統汁方法比較替代方法的檢驗結果與藥典方法結果的差異,從而評價替代方法的定量限。
3.4.5 5.線性
微生物定量檢驗的線性是指在一定範圍內,檢驗結果與樣品中微生物數量成比例關係的程度。線性驗證時必須覆蓋能夠準確測定的所有濃度範圍。每株試驗菌應選擇至少5個濃度,每個濃度至少測定5次。根據以上實驗數據,以檢驗結果爲因變量,以樣品中微生物的預期數量爲自變量進行線性迴歸分析,計算相關係數r。當相關係數不能準確評估線性時,只能確定簡單大約的關係值。替代方法的相關係數不得低於0.95。
3.4.6 6.範圍
微生物定量檢驗的範圍是指能夠達到一定的準確度、精密度和線性,檢驗方法適用的高低限濃度或數量的區間。
3.4.7 7.重現性
微生物定量檢驗的重現性是指相同的樣品在正常的實驗條件(如實驗地點、實驗人員、儀器、試劑的批次等)發生變化時,所得檢驗結果的精密度。重現性可視爲微生物檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環境變化的能力。方法使用者應優先測定該驗證參數。在樣品中接種一定數量的試驗菌(接種量應在定量限以上).採用藥典方法和替代方法,分別由不同人員,在不同時間,使用不同的試劑(或儀器)進行檢驗,對檢驗結果進行統計分析,以相對標準偏差(RSD)來評價兩種方法的重現性差異。驗證過程中,應關注樣品的一致性。
3.4.8 8.耐用性
微生物定量檢驗的耐用性是指當方法參數有小的刻意變化時,檢驗結果不受影響的能力,爲方法正常使用時的可靠性提供依據。方法使用者應優先測定該驗證參數。與藥典方法比較,若替代方法檢驗條件較爲苛刻,則應在方法中加以說明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的,但應單獨對替代方法的耐用性進行評價,以便使用者瞭解方法的關鍵操作點。