1 拼音
2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù XV
滅菌法系指用適當的物理或化學手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降至預期的無菌保證水平的方法。本法適用於製劑、原料、輔料及醫療器械等物品的滅菌。
無菌物品是指物品中不含任何活的微生物。對於任何一批滅菌物品而言，絕對無菌既無法保證也無法用試驗來證實。一批物品的無菌特性只能相對地通過物品中活微生物的概率低至某個可接受的水平來表述，即無菌保證水平（sterility assurance level，簡稱SAL）。實際生產過程中，滅菌是指將物品中污染微生物的概率下降至預期的無菌保證水平。最終滅菌的物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高於10-6。已滅菌物品達到的無菌保證水平可通過驗證確定。
滅菌物品的無菌保證不能依賴於最終產品的無菌檢驗，而是取決於生產過程中採用合格的滅菌工藝、嚴格的GMP管理和良好的無菌保證體系。滅菌工藝的確定應綜合考慮被滅菌物品的性質、滅菌方法的有效性和經濟性、滅菌後物品的完整性和穩定性等因素。
滅菌程序的驗證是無菌保證的必要條件。滅菌程序經驗證後，方可交付正式使用。驗證內容包括：
（2）確認滅菌設備技術資料齊全、安裝正確，並能處於正常運行（安裝確認）。
（3）確認滅菌沒備、關鍵控制和記錄系統能在規定的參數範圍內正常運行（運行確認）。
（4）採用被滅菌物品或模擬物品按預定滅菌程序進行重複試驗，確認各關鍵工藝參數符合預定標準，確定經滅菌物品的無菌保證水平符合規定（性能確認）。
（5）彙總並完善各種文件和記錄，撰寫驗證報告。
日常生產中，應對滅菌程序的運行情況進行監控，確認關鍵參數（如溫度、壓力、時間、溫度、滅菌氣體濃度及吸收的輻照劑量等）均在驗證確定的範圍內。滅菌程序應定期進行再驗證。當滅菌設備或程序發生變更（包括滅菌物品裝載方式和數量的改變）時，應進行再驗證。
物品的無菌保證與滅菌工藝、滅菌前物品被污染的程度及污染菌的特性相關。因此，應根據滅菌工藝的特點制定滅菌物品滅菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受限度並進行監控，並在生產的各個環節採取各種措施降低污染，確保微生物污染控制在規定的限度內。
滅菌的冷卻階段，應採取措施防止已滅菌物品被再次污染。任何情況下，都應要求容器及其密封系統確保物品在有效期內符合無菌要求。
1.1 滅菌方法
常用的滅菌方法有溼熱滅菌法、乾熱滅菌法、輻射滅菌法、氣體滅菌法和過濾除菌法。可根據被滅菌物品的特性採用一種或多種方法組合滅菌。只要物品允許，應儘可能選用最終滅菌法滅菌。若物品不適合採用最終滅菌法，可選用過濾除菌法或無菌生產工藝達到無菌保證要求，只要可能，應對非最終滅菌的物品作補充性滅菌處理（如流通蒸汽滅菌）。
1.1.1 一、溼熱滅菌法
本法系指將物品置於滅菌櫃內利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質、核酸發生變性而殺滅微生物的方法。該法滅菌能力強，爲熱力滅菌中最有效、應用最廣泛的滅菌方法。藥品、容器、培養基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮溼不發生變化或損壞的物品，均可採用本法滅菌。流通蒸汽不能有效殺滅細菌孢子，一般可作爲不耐熱無菌產品的輔助滅菌手段。
溼熱滅菌條件的選擇應考慮被滅菌物品的熱穩定性、熱穿透力、微生物污染程度等因素。溼熱滅菌條件通常採用121℃×15min、121℃×36min或116℃×40min的程序，也可採用其他溫度和時間參數，但無論採用何種滅菌溫度和時間參數，都必須證明所採用的滅菌工藝和監控措施在日常運行過程中能確保物品滅菌後的SAL≤10-6。當滅菌程序的選定採用F0值概念時（F0值爲標準滅菌時間，系滅菌過程賦予被滅菌物品121℃下的滅菌時間），應採取特別措施確保被滅菌物品能得到足夠的無菌保證，此時，除對滅菌程序進行驗證外，還必須在生產過程中對微生物進行監控，證明污染的微生物指標低於設定的限度。對熱穩定的物品，滅菌工藝可首選過度殺滅法，以保證被滅菌物品獲得足夠的無菌保證值。熱不穩定性物品，其滅菌工藝的確定依賴於在一定的時間內，一定的生產批次的被滅菌物品滅菌前微生物污染的水平及其耐熱性。因此，日常生產全過程應對產品中污染的微生物進行連續地、嚴格地監控，並採取各種措施降低物品微生物污染水平，特別是防止耐熱菌的污染。熱不穩定性物品的F0值一般不低於8分鐘。
採用溼熱滅菌時，被滅菌物品應有適當的裝載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。
溼熱滅菌法應確認滅菌櫃在不同裝載時可能存在的冷點。當用生物指示劑進一步確認滅菌效果時，應將其置於冷點處。本法常用的生物指示劑爲嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus stearothermophilus）。
1.1.2 二、乾熱滅菌法
本法系指將物品置於乾熱滅菌櫃、隧道滅菌器等設備中，利用於熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質的方法。適用於耐高溫但不宜用溼熱滅菌法滅菌的物品滅菌，如玻璃器具、金屬制容器、纖維製品、固體試藥、液狀石蠟等均可採用本法滅菌。
乾熱滅菌條件一般爲160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×45min以上，也可採用其他溫度和時間參數。無論採用何種滅菌條件，均應保證滅菌後的物品的SAL≤10-6。採用乾熱過度殺滅後的物品一般無需進行滅菌前污染微生物的測定。250℃×45min的乾熱滅菌也可除去無菌產品包裝容器及有關生產灌裝用具中的熱原物質。
採用於熱滅菌時，被滅菌物品應有適當的裝載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。
乾熱滅菌法應確認滅菌櫃中的溫度分佈符合設定的標準及確定最冷點位置等。常用的生物指示劑爲枯草芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus subtilis）。細菌內毒素滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將不小於1000單位的細菌內毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內毒素至少下降3個對數單位。細菌內毒素滅活驗證試驗所用的細菌內毒素一般爲大腸埃希菌內毒素（Escherichia coli endoxin）。
1.1.3 三、輻射滅菌法
本法系指將物品置於適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法。本法最常用的爲60Co-γ射線輻射滅菌。醫療器械、容器、生產輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。
採用輻射滅菌法滅菌的無菌物品其SAL應≤10-6。γ射線輻射滅菌所控制的參數主要是輻射劑量（指滅菌物品的吸收劑量）。該劑量的制定應考慮滅菌物品的適應性及可能污染的微生物最大數量及最強抗輻射力，事先應驗證所使用的劑量不影響被滅菌物品的安全性、有效性及穩定性。常用的輻射滅菌吸收劑量爲25kGy。對最終產品、原料藥、某些醫療器材應儘可能採用低輻射劑量滅菌。滅菌前，應對被滅菌物品微生物污染的數量和抗輻射強度進行測定，以評價滅菌過程賦予該滅菌物品的無菌保證水平。對於已設定的劑量，應定期審覈，以驗證其有效性。
滅菌時，應採用適當的化學或物理方法對滅菌物品吸收的輻射劑量進行監控，以充分證實滅菌物品吸收的劑量是在規定的限度內。姍採用與滅菌物品，一起被輻射的放射性劑量計，劑量計要置於規定的部位。在初安裝時劑量計應用標準源進行校正，並定期進行再校正。
60Co-γ射線輻射滅菌法常用的生物指示劑爲短小芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus pumilus）。
1.1.4 四、氣體滅菌法
本法系指用化學消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。常用的化學消毒劑有環氧乙烷、氣態過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等，本法適用於在氣體中穩定的物品滅菌。採用氣體滅菌法時，應注意滅菌氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。
本法中最常用的氣體是環氧乙烷，一般與80%～90%的惰性氣體混合使用，在充有滅菌氣體的高壓腔室內進行。該法可用於醫療器械、塑料製品等不能採用高溫滅菌的物品滅菌。含氯的物品及能吸附環氧乙烷的物品則不宜使用本法滅菌。
採用環氧乙烷滅菌時，滅菌櫃內的溫度、溼度、滅菌氣體濃度、滅菌時間是影響滅菌效果的重要因素。可採用下列滅菌條件：
溫度 54℃±10℃相對溼度 60%±10%滅菌壓力 8×105Pa
滅菌時間 90min滅菌條件應予驗證。滅菌時，將滅菌腔室抽成真空，然後通人蒸汽使腔室內達到設定的溫溼度平衡的額定值，再通人經過濾和預熱的環氧乙烷氣體。滅菌過程中，應嚴密監控腔室的溫度、溼度、壓力、環氧乙烷濃度及滅菌時間。必要時使用生物指示劑監控滅菌效果。本法滅菌程序的控制具有一定難度，整個滅菌過程應在技術熟練人員的監督下進行。滅菌後，應採取新鮮空氣置換，使殘留環氧乙烷和其他易揮發性殘留物消散，並對滅菌物品中的環氧乙烷殘留物和反應產物進行監控，以證明其不超過規定的濃度，避免產生毒性。
採用環氧乙烷滅菌時，應進行泄漏試驗，以確認滅菌腔室的密閉性。滅菌程序確認時，還應考慮物品包裝材料和滅菌腔室中物品的排列方式對滅菌氣體的擴散和滲透的影響。生物指示劑一般採用枯草芽孢桿菌孢子（ Sporesof Bacillus subtilis）。
1.1.5 五、過濾除菌法
本法系利用細菌不能通過緻密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用於氣體、熱不穩定的藥品溶液或原料的除菌。
除菌過濾器採用孔徑分佈均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質依過濾物品的性質及過濾目的而定。藥品生產中採用的除菌濾膜孔徑一般不超過0.22μm。過濾器的孔徑定義來自過濾器對微生物的截留，而非平均孔徑的分佈係數。所以，用於最終除菌的過濾器必須選擇具有截留實驗證明的除菌級過濾器。過濾器對濾液的吸附不得影響藥品質量，不得有纖維脫落，禁用含石棉的過濾器。過濾器的使用者應瞭解濾液過濾過程中的析出物性質、數量並評估其毒性影響。濾器和濾膜在使用前應進行潔淨處理，並用高壓蒸汽進行滅菌或做在線滅菌。更換品種和批次應先清洗濾器，再更換濾芯或濾膜或直接更換濾器，
過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負荷及過濾器的對數下降值LRV （log reduction value）有關。LRV係指規定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數量與過濾後的微生物數量比的常用對數值。即：
LRV=lgN0-lgN式中 N0爲產品除菌前的微生物數量；N爲產品除菌後的微生物數量。LRV用於表示過濾器的過濾除菌效率，對孔徑爲0.22μm的過濾器而言，要求每1cm2有效過濾面積的LRV應不小於7。因此過濾除菌時，被過濾產品總的污染量應控制在規定的限度內。爲保證過濾除菌效果，可使用兩個除菌級的過濾器串連過濾，或在灌裝前用過濾器進行再次過濾。
在過濾除菌中，一般無法對全過程中過濾器的關鍵參數（濾膜孔徑的大小及分佈，濾膜的完整性及LRV）進行監控。因此，在每一次過濾除菌前後均應做濾器的完整性試驗，即氣泡點試驗或壓力維持試驗或氣體擴散流量試驗，確認濾膜在除菌過濾過程中的有效性和完整性。完整性的測試標準來自於相關細菌截留實驗數據。除菌過濾器的使用時間應進行驗證，一般不應超過一個工作日。
過濾除菌法常用的生物指示劑爲缺陷假單胞菌 （Pseudomonas diminuta）。
通過過濾除菌法達到無菌的產品應嚴密監控其生產環境的潔淨度，應在無菌環境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其他物品應採用適當的方法進行滅菌，並防止再污染。
1.1.6 六、無菌生產工藝
無菌生產工藝係指必須在無菌控制條件下生產無菌製劑的方法，無菌分裝及無菌凍於是最常見的無菌生產工藝。後者在工藝過程中須採用過濾除菌法。
無菌生產工藝應嚴密監控其生產環境的潔淨度，並應在無菌控制的環境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其他物品應採用適當的方法進行滅菌，並防止被再次污染。
無菌生產工藝過程的無菌保證應通過培養基無菌灌裝模擬試驗驗證。在生產過程中，應嚴密監控生產環境的無菌空氣質量、操作人員的素質、各物品的無菌性。無菌生產工藝應定期進行驗證，包括對環境空氣過濾系統有效性驗證及培養基模擬灌裝試驗。
1.2 生物指示劑
生物指示劑系一類特殊的活微生物製品，可用於確認滅菌設備的性能、滅菌程序的驗證、生產過程滅菌效果的監控等。用於滅菌驗證中的生物指示劑一般是細菌的孢子。
1.2.1 1．製備生物指示劑用微生物的基本要求
不同的滅菌方法使用不同的生物指示荊，製備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：
（1）菌種的耐受性應大於需滅菌物品中所有可能污染菌的耐受性。
（2）菌種應無致病性。
（4）易於培養。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90%以上。
1.2.2 2．生物指示劑的製備
生物指示劑的製備應按一定的程序進行，製備前，需先確定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐熱參數，係指一定溫度下，將微生物殺滅90%所需的時間，以分鐘表示）等。菌株應用適宜的培養基進行培養。培養物應制成懸浮液，其中孢子的數量應占優勢，孢子應懸浮於無營養的液體中保存。
生物指示劑中包含一定數量的一種或多種孢子，可製成多種形式。通常是將一定數量的孢子附着在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不鏽鋼、塑料製品等；孢子懸浮液也可密封於安瓿中；有的生物指示劑還配有培養基系統。D值除與滅菌條件相關外，還與微生物存在的環境有關。因此，一定形式的生物指示劑製備完成後，應測定D值和孢子總數。生物指示劑應選用合適的材料包裝，並設定有效期。載體和包裝材料在保護生物指示劑不致污染的同時，還應保證滅菌劑穿透並能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝的設計原則是便於貯存、運輸、取樣、轉移接種。
有些生物指示劑可直接將孢子接種至液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應用數據證明二者的等效性。
1.2.3 3．生物指示劑的應用
在滅菌程序的驗證中，儘管可通過滅菌過程某些參數的監控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性最直觀的指標。可使用市售的標準生物指示劑，也可使用由日常生產污染菌監控中分離的耐受性最強的微生物製備的孢子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的D值，並測定孢子的純度和數量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在最終滅菌法中，生物指示劑應放在滅菌櫃的不同部位，並避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌後取出，分別置培養基中培養，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。
過度殺滅產品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可採用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產品，設計滅菌程序時，根據經驗預計在該生產工藝中產品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數量。這類產品的無菌保證應通過監控每批滅菌前的微生物污染的數量、耐受性和滅菌程序驗證所獲得的數據進行評估。
1.2.4 4．常用生物指示劑
（1）溼熱滅菌法 溼熱滅菌法最常用的生物指示劑爲嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953）。D值爲1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子數5×105～5×106個，在121℃、19min下應被完全殺滅。此外，還可使用生孢梭菌孢子（Spores of Clostridium sporogenes，如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955），D值爲0.4～0.8min。
（2）乾熱滅菌法 乾熱滅菌法最常用的生物指示劑爲枯草芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372）。D值大於1.5min，每片活孢子數5×105～5×106個。去熱原驗證時使用大腸埃希菌內毒素（Escherichia coli endoxin），加量不小於1000細菌內毒素單位。
（3）輻射滅菌法 輻射滅菌法最常用的生物指示劑爲短小芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142）。每片活孢子數107～108，置於放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy，但應注意滅菌物品中所負載的微生物可能比短小芽孢桿菌孢子顯示更強的抗輻射力。因此短小芽孢桿菌孢子可用於監控滅菌過程，但不能用於滅菌輻射劑量建立的依據。
（4）氣體滅菌法 環氧乙烷滅菌最常用的生物指示劑爲枯草芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10073、ATCC 9372）。氣態過氧化氫滅菌最常用的生物指示劑爲嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillusstearothermophilus，如 NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953）。每片活孢子數1×106～5×106個。環氧乙烷滅菌中，枯草芽孢桿菌孢子D值大於2.5min，在環氧乙烷濃度爲600mg/L，相對溼度爲60%，溫度爲54℃下滅菌，60min應被殺滅。
（5）過濾除菌法 過濾除菌法最常用的生物指示劑爲缺陷假單胞菌（Pseudomonas diminuta，如ATCC19146），用於濾膜孔徑爲0.22μm的濾器；黏質沙雷菌（Serratia marcescens）（ATCC 14756）用於濾膜孔徑爲0.45μm的濾器。