微生物限度檢查法_註解、微生物限度檢查法是什麼

當比值≤2時，以兩稀釋級的均值報告，當比值＞2時，以低稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告；如同時有3個稀釋級的平均菌落數均在30～300之間時,以後2個稀釋級計算級間比值報告；如各稀釋級的平均菌落數均不在30～300之間，以最接近30或300的稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告；如各稀釋級平均菌落數均在300(100)以上，按最高稀釋級菌落數乘以稀釋倍數報告；如各稀釋級平均菌落數均小於30時，一般按最低稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告。如當1:10（或1:100 ）稀釋級平均菌落數等於或大於原液（或1:10稀釋級）時，應以培養基稀釋法測定，按測定結果報告菌數。

(2) 培養基稀釋法

取供試液（原液或1:10供試液）3份，每份各1ml,分別注入5個平皿內（每皿各0.2ml）。每1個平皿傾注營養瓊脂培養基約15ml，混勻，凝固後，倒置培養，計數。每1ml注入的5個平板點計的菌落數之和，即爲每1ml的菌落數，共得3組數據。以3份供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。

如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數小於1時,則報告菌數爲小於10個。

2 、控制菌檢查

除另有規定外，取供試液10ml(相當供試品1g、1ml 、10cm<2>),直接或處理後接種，經增菌分離培養後，進行革蘭氏染色、生化試驗與血清凝集試驗項檢查。

(1) 大腸桿菌(Escherichia coli)

取膽鹽乳糖培養基3份，每份各100ml,2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對照。培養18～24小時（必要可延至48小時）。空白對照應無菌生長。其餘2份培養物劃線接種於曙紅亞甲藍瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板,培養18～24小時。當陽性對照的平板呈陽性菌落時,供試品的平板無菌落生長,或有菌落但不同於表1所列的特徵,可判爲未檢出大腸桿菌。

表 1　大腸桿菌菌落形態特徵

───────┬──────────────────
　　培養基　　│　　　 菌　　落　　形　　態
───────┼──────────────────
曙紅亞甲藍瓊脂│呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，
　　　　　　│菌落中心深紫色或無明顯暗色中心，圓
　　　　　　│形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，溼
　　　　　　│潤，常有金屬光澤。
───────┼──────────────────
 麥康凱瓊脂 │鮮桃紅色或微紅色，菌落中心深桃紅色，
  　　　　　│圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，溼潤。
───────┴──────────────────

如生長的菌落與表1所列特徵相符或疑似者,應挑選2～3個菌落分別接種於營養瓊脂培養基斜面，培養18小時，作以下檢查：

革蘭氏染色

取上述斜面培養物，塗片，固定。以結晶紫染液染色1分鐘,水洗，革蘭氏碘液媒染1分鐘，水洗，濾紙吸乾餘水。以乙醇脫色20～30秒鐘,水洗。滴加沙黃染液復染1分鐘，待幹後鏡檢。

乳糖發酵試驗

取上述斜面培養物，接種於乳糖發酵管，培養24～48小時，觀察產酸（培養基變色），產氣（杜氏管內有氣泡）。

靛基質試驗

取上述斜面培養物，接種於蛋白腖水培養基中，培養48±2小時,沿管壁加入對靛基質試液0.3～0.5ml，液麪呈玫瑰紅色爲陽性，呈試劑本色爲陰性。

甲基紅試驗

取上述斜面培養物，接種於磷酸鹽葡萄糖腖水培養基中,培養48±2小時，於每1ml培養液中加入甲基紅指示劑1滴，立即觀察，呈鮮紅色或桔紅色爲陽性，呈黃色爲陰性。

乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P 試驗）

取上述斜面培養物，接種於磷酸鹽葡萄糖腖水培養基，培養48±2小時，於每2ml培養液中加入α-萘酚乙醇液1ml，混勻，再加40％氫氧化鉀溶液0.4ml，充分振搖，出現紅色爲陽性。加試劑4小時內，如出現紅色亦應判爲陽性，無紅色反應爲陰性。

枸櫞酸鹽利用試驗

取上述斜面培養物，接種於枸櫞酸鹽培養基的斜面上，培養48±2小時,培養基斜面有菌苔生長，培養基由綠色變爲藍色時爲陽性，培養基顏色無改變時爲陰性。

當空白對照試驗呈陰性，供試品檢查爲革蘭氏陰性無芽孢桿菌；乳糖發酵產酸產氣或產酸不產氣；IMViC 試驗爲陽性、陽性、陰性、陰性或陰性、陽性、陰性、陰性，判爲檢出大腸桿菌。對可疑反應的菌株，應重新分離培養後，再作生化試驗證實。

(2) 沙門氏菌(Salmonella species)

取營養肉湯培養基3份，每份各100ml,2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對照。培養18～24小時，空白對照應無菌生長。取其餘2份培養液各1ml，分別接種於四硫磺酸鈉亮綠培養基10ml中，培養18～24小時。分別劃線接種於膽鹽硫乳瓊脂（或沙門氏、志賀氏菌屬瓊脂）培養基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養基的平板上，培養18～24小時或延至40～48小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時，供試品的平板無菌落生長，或有菌落但不同於表2所列特徵時，可判爲未檢出沙門氏菌。

如供試品平板生長的菌落特徵有與表2所列菌落形態特徵相符或疑似者，均應挑選2～3個菌落分別接種於叄糖鐵瓊脂培養斜面上，陽性對照同時接種,培養18～24小時後，陽性對照的斜面應爲紅色，底層爲黃色，硫化氫陽性，而供試品疑似菌斜面未見紅色、底層未見黃色，可判爲未檢出沙門氏菌。否則，應繼續做革蘭氏染色、生化試驗、動力檢查與血清凝集試驗。

表2　沙門氏菌菌落形態特徵

───────┬────────────────────────────
　　培養基　　│　　　　　　　　　菌　　落　　形　　態
───────┼────────────────────────────
膽鹽硫乳瓊脂　│無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色。
───────┼────────────────────────────
沙門氏、志賀　│無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色。氏菌屬瓊脂
───────┼────────────────────────────
曙紅亞甲藍瓊脂│無色至淺橙色，透明或半透明，光滑溼潤的圓形菌落。
───────┼────────────────────────────
麥康凱瓊脂　　│無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時爲暗色。
───────┴────────────────────────────

革蘭氏染色

照大腸桿菌項下方法操作，鏡檢。

靛基質試驗

照大腸桿菌項下操作並判斷結果。

尿素酶試驗

取疑似菌斜面培養物接種於尿素瓊脂培養基斜面上，培養24小時，斜面變爲紅色爲陽性，不變色爲陰性。

氰化鉀試驗

取培養20～24小時的疑似菌株營養肉湯培養液，分別用白金耳沾取1環，接種至對照培養基及氰化鉀培養基內，立即以橡膠塞塞緊，培養24～48小時，對照管應有菌生長，試驗管有菌生長者爲陽性，無菌生長爲陰性。

賴氨酸脫羧酶試驗

取疑似菌斜面培養物分別接種賴氨酸脫羧酶培養基及對照培養基上。培養24～48小時，對照管應爲黃色，試驗管呈紫色爲陽性，呈黃色爲陰性。

動力檢查

取疑似菌斜面培養物穿刺接種於半固體營養瓊脂培養基管中，培養24小時，細菌沿穿刺線外周擴散生長，爲動力陽性，否則爲陰性。陰性培養物，應在室溫保留2～3天后，再判斷。

血清凝集試驗

在潔淨載玻片一端，以白金耳沾取沙門氏菌屬A～F“0” 多價血清2～3環，再取斜面上部的培養物少許，與血清混合，將玻片前後側動,如出現凝集現象,應以0.9％氯化鈉溶液與同株培養物作對照試驗,無凝集現象時判爲血清凝集陽性。時有反應遲緩，需將玻片與溼棉球置平皿內，約過20分鐘，再觀察。仍未出現凝集時，應取斜面培養物，置含少量0.9％氯化鈉溶液的試管中，製成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30分鐘，待冷，再作凝集試驗。如出現凝集，應判爲陽性，否則爲陰性。

上述各項試驗反應，一般應爲硫化氫陽性（或陰性），靛基質陰性，尿素酶陰性,氰化鉀陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，動力檢查陽性，A～F“0” 多價血清凝集試驗陽性。各鑑定結果按表3判定。

表3　沙門氏菌檢查結果判定

──┬─────────────────┬────┬─────────
　序│　　　　　　　 血清凝集試驗 　　　│　　　　│
　　│　　　　　　 (A～F“0” 血清) 　　│　　　　│
　　├──┬───────┬──────┤生化試驗│　　結　　果
　　│凝集│　100℃30分鐘 │0.9％氯化鈉 │　　　　│
　號│反應│　　凝集反應　│溶液對照　　│　　　　│
──┼──┼───────┼──────┼────┼─────────
　1 │陽性│　 陽　　性 　│　陰　　性　│　符　合│檢出沙門氏菌
　2 │陰性│　 陽　　性 　│　陰　　性　│　符　合│檢出沙門氏菌
　3 │陰性│　 陰　　性 　│　　　　　　│　不符合│未檢出沙門氏菌
──┴──┴───────┴──────┴────┴─────────

上述各項試驗任何一項不符合或有可疑反應的培養物,均應進一步鑑定後作出結論。

(3) 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)

取膽鹽乳糖培養基3份，每份各100ml，2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作爲陽性對照,第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對照。培養18～24小時，空白對照應無菌生長,其餘2份培養液劃線接種於十六烷叄甲基溴化銨瓊脂培養基平板上，培養18～24小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時，供試品的平板無菌落或無疑似菌落生長，可判爲未檢出綠膿桿菌。

綠膿桿菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散，表面溼潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如生長菌落具有上述特徵或疑似者，應挑選2～3個菌落，分別接種營養瓊脂培養基斜面上，培養18～24小時，取培養物革蘭氏染色，並作氧化酶試驗。

氧化酶試驗

取潔淨濾紙片置於平皿內，用無菌玻璃棒取營養瓊脂培養基斜面培養物塗於濾紙片上，再滴加新配製的1％二甲基對苯二胺鹽酸鹽試液,在30秒內呈粉紅色逐漸變爲紫紅色爲氧化酶試驗陽性。否則爲陰性。

如證實爲非革蘭氏陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均可判爲未檢出綠膿桿菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。

綠膿菌素(Pyocyanin) 試驗

取上述瓊脂斜面培養物，接種於綠膿菌素測定用培養基斜面上，培養24小時後，在試管內加氯仿3～5ml,攪碎培養基並充分振搖。靜置片刻,將氯仿移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸溶液約1ml,振搖後，靜置片刻，如在鹽酸溶液層內出現粉紅色，即爲綠膿菌素陽性。試驗同時應有空白對照試驗。

當空白對照試驗呈陰性時，供試品檢查爲革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素陽性、可判定爲檢出綠膿桿菌。

綠膿菌素陰性的培養物，應繼續以下試驗。

硝酸鹽還原產氣試驗

取營養瓊脂培養基斜面培養物,接種於硝酸鹽腖水培養基中,培養24小時，如在培養基的杜氏管中有氣體產生，即爲陽性。

42℃生長試驗營養瓊脂培養基斜面培養物於0.9％無菌氯化鈉溶液中,製成菌懸液,再將菌懸液接種於營養瓊脂培養基斜面上，立即置41±1℃水浴中培養24～48小時,有菌苔生長者爲陽性；否則爲陰性。

明膠液化試驗

以接種針沾取營養瓊脂培養基斜面培養物，穿刺於明膠培養基內，培養24小時，取出置冰箱內10～30分鐘。如培養基仍呈溶液狀，爲陽性。

當革蘭氏陰性桿菌，氧化酶試驗陽性，綠膿菌素試驗爲陰性，其硝酸鹽還原產氣試驗、42℃生長試驗及明膠液化試驗均爲陽性時，應判爲檢查綠膿桿菌。

(4) 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

取亞碲酸鈉肉湯（或營養肉湯）培養基3份，每份各100ml，2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作爲陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋劑作爲空白對照。均培養18～24小時(必要時可延至48小時)。空白對照應無菌生長。取其餘2份培養液劃線接種於卵黃高鹽瓊脂培養基平板上或甘露醇高鹽瓊脂培養基平板上，培養24～72小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時，供試品的平板如無菌落生長，或有菌落但不同於表4所列特徵,可判爲未檢出金黃色葡萄球菌。

表4　金黃色葡萄球菌菌落形態特徵

─────┬─────────────────
　　培養基　│　　　菌　　落　　形　　態
　─────┼─────────────────
  卵黃高鹽　│金黃色、圓形凸起，邊緣整齊，外圍有瓊脂
      　　　│卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1～2mm
  ─────┼─────────────────
  甘露醇高鹽│金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有瓊脂
　      　　│黃色環，菌落直徑約0.7～1mm
　─────┴─────────────────

如有菌落生長並與表4所列特徵相符或疑似時,應挑選2～3個菌落，分別接種於營養瓊脂培養基斜面上，培養18～24小時，取其培養物革蘭氏染色，並作血漿凝固酶試驗。

血漿凝固酶試驗

取滅菌小試管3支，各加入血漿①－無菌水(1:1)0.5ml，1支加入被檢菌株的營養肉湯培養液（或濃菌懸液）0.5ml,其餘2支作對照管；1支加入金黃色葡萄球菌的營養肉湯培養液或菌懸液0.5ml作陽性對照;另1支加入營養肉湯或0.9％氯化鈉溶0.5ml作空白對照。將3管同時培養。3小時後開始檢查,以後適當時間逐次觀察直至24小時。空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固，試驗管血漿凝固者爲陽性；陽性對照管和空白對照管任何一管不符合要求時，應另製備血漿，重新試驗。

當空白對照和陽性對照符合要求，供試品的菌株爲革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗陽性，判定爲檢出金黃色葡萄球菌。

結果判斷

細菌菌落數、黴菌（酵母菌）菌落數、控制菌叄項均符合該品種微生物限度項下規定，應判供試品合格；其中任何一項不符合該品種項下規定，應判供試品不合格。

細菌菌落數、黴菌(酵母菌)菌落數第一次測定超過該品種項下微生物限度規定時，應從同一批號樣品中隨機抽樣，複試兩次，以叄次結果平均值報告。

眼科用藥的黴菌和酵母菌菌落數複試報告，須以二次複試結果均不得長菌，方可判爲供試品合格。

如發現營養瓊脂培養基平板生長黴菌（酵母菌）菌落數或虎紅瓊脂培養基平板上生長細菌菌落數超過該品種項下微生物限度規定時，應判爲供試品不合格。

各類製劑檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果爲準，不再抽樣複試，即應判該供試品不合格。

①

血漿的製備

以無菌注射器吸取滅菌的含5％枸櫞酸鈉的0.9％氯化鈉溶液1ml,用無菌操作採取家兔（或羊、人）血9ml,輕輕混勻數分鐘。待血液不凝固時，徐徐放入滅菌離心管中，離心，分離血漿，用滅菌吸管取血漿移至滅菌試管中，置冰箱內備用。臨用前必須用已知血漿凝固酶試驗陽性的金黃色葡萄球菌測試，證明血漿合格後，方可用於試驗。

微生物限度檢查法

目錄

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1 拼音

2 註解

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