3 人二倍體細胞建株、檢定及製備疫苗規程
3.1 細胞株的要求
用於疫苗生產的人二倍體細胞株(以下簡稱細胞株)須按下列規定進行全面檢定。新建立細胞株,應按《新生物製品審批辦法》進行審批。
1 建立細胞株必須具備下列資料
1.2 建立細胞株所用胎兒的父、母年齡、職業及健康狀況,胎兒父、母系三代應無明顯遺傳缺陷和腫瘤疾病歷史。在取胎兒組織時,應作出詳細調查,報衛生部審批前,應進行一次重複調查。
2 細胞株的檢定
細胞原系建株過程,每8~12世代*應作一次染色體檢查,一株細胞整個生命期內連續培養過程中,至少應有4~5次染色體檢查結果。
每次染色體檢查,應從同一世代不同細胞培養瓶中取細胞混合再培養,製備染色體標本片。染色體標本應長期保存(直至褪色不能用爲止),以備複查。
每次染色體檢查,至少應隨機取1000個分裂中期細胞,進行染色體數目、形態和結構檢查,並作出有助於複查的記錄,其中至少選擇50個分裂中期細胞進行顯微照相,作出核型分析。並應粗數500個分裂中期細胞,檢查多倍體的發生率。
可以G分帶或Q分帶技術檢查50個中期細胞染色體帶型,應用照相圖片作出帶型分析。以顯帶技術檢出的核型異常(假二倍體、倒位、易位等)發生率應用比現用上限更寬的基本數據進行評價,合格上限尚未定出。
2.1.1 合格要求
1000個和500個中醫細胞標本中,檢查異常率、合格的上限(可信限95%,Poison法)如表1。
表1
*亞二倍性超過上限時,可選用批標本片重數
2.1.2 染色體製片要求
應及時進行製片質量檢查,如發現細胞堆積,染色體分散不好等,由於技術原因不適於讀片時,可以及時重新制片。但已經讀片後,不斷因某項超過標準(亞二位性除外)而廢棄不算。如考慮到製片技術與質量問題,可重試兩次,當有一次結果與原結果相近時,又無可知原因,應以原結果爲準。
細胞株不應有細菌、黴菌、支原體和病毒等污染。每8~12世代細胞培養物,應進行下列檢查。
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
取混合瓶細胞樣品,接種小瓶或小管,長成單層後更換維持液,觀察2周,鏡檢細胞,應保持正常形態特徵。培養7天,用0.2%~0.5%雞和豚鼠混合紅細胞懸液進行紅細胞吸附試驗,先置於4~8℃,後置於20~25℃,各30分鐘,兩次觀察結果均應爲陰性。
細胞培養的上清液混合樣品,至少接種4種細胞(原代人腎或猴腎細胞、原代兔腎細胞、人源傳代細胞和另一批人二倍體細胞)。接種的樣品量應占維持液的20%以上,於培養5~7天和14天時,進行紅細胞吸附試驗(見2.2.2.1項)。培養7天的上清液在同種細胞培養上盲傳一代,觀察14天,應無細胞病變,紅細胞吸附試驗應爲陰性(在該試驗的細胞維持液中,允許加入少量該細胞培養用的牛血清,以利細胞維持和觀察)。
2.2.2.3 動物試驗檢查
用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和雞胚各一組。每組動物或雞胚接種受檢細胞不應少於107。按表2所列要求進行試驗和觀察。如80%以上動物和雞胚健存,此試驗爲通過。
2.2.2.4 其他檢查
細胞株傳代過程中,至少於2個不同世代水平進行包涵體、乙型肝炎表面抗原及電鏡檢查,結果均應爲陰性。
每8~12世代做一次細胞株的異種移植試驗,觀察細胞株有無致腫瘤性質,每次實驗使用6只乳鼠(3~5日齡)或體重8~10g小白鼠,經抗胸腺血清(ATS)處理,皮下接種活二倍體細胞(最適傳代的細胞),觀察14天,檢查有無結節形成。有結節或可疑病竈時,做病理切片檢查。試驗同時,用HeLa或其他人源傳代細胞系做陽性對照試驗,用動物數與處理方法同試驗組,接種被檢二倍體細胞數應爲對照腫瘤細胞數的5倍以上。結果二倍體細胞株不應有移植瘤形成,而對照組細胞則應有80%或更多的動物有典型移植瘤出現(腫瘤結節需經病理組織學診斷)。
表2
動物組別 | 要求 | 動物或雞胚數 | 接種途徑 | 接種細胞懸液量 (ml/只) | 觀察天數 | 結果 |
乳鼠 | 24小時內 | 2窩≥10 | 腦內 腹腔 | 0.01 0.1 | 21 | 應健存 |
成鼠 | 12~14g | 10 | 腦內 腹腔 | 0.03 0.5 | 21 | 應健存 |
豚鼠 | 350~500g | 5 | 腹腔 | 5.0 | 42 | 應健存,解剖無結核病變 |
家兔 | 1.5~2.5kg | 5 | 皮內 皮下 | 0.1×10** 9.0 | 21 | 無異常 健存 |
雞胚 | 9~11日齡 | 10 | 尿囊腔 | 0.2 | 3~4 | 尿液血凝試驗陰性*** |
**每隻於背部皮內注射10處,每處0.1ml
***應用豚鼠和雞混合紅細胞作直接血凝試驗
可以用任何以免疫抑制劑處理,並對腫瘤細胞有同樣敏感性的其他動物試驗,如無胸腺小白鼠(nude nu/nu基因型等)。
細胞株傳代過程的早期,應選定適應世代數培養出大量細胞,製成懸液,分裝安瓿作爲細胞種子。置液氮中凍存,以備細胞株建成後,大量供應細胞。
凍存的種子細胞活存率應在60%以上。凍存後一定時間,應至少復甦培養一系至衰老期,並在不同傳代水平,檢查細胞株的生長、胞核學特徵、異種移植等,證明細胞經凍存後的生物學性質無明顯改變。
3.2 二倍體細胞用於疫苗生產的要求
1 細胞
1.1 細胞株
用於疫苗生產的細胞株,必須符合本規程要求。不含外源因子、核型正常、對病毒敏感和具有足夠多的細胞種子。可用KMB-17、2BS等細胞株。所用細胞株均須經衛生部批准。
一個細胞種子批應有足夠量早世代細胞,分裝安瓿保存於液氮中,作爲細胞種子。
用一個或數個細胞種子安瓿傳代增殖到適宜世代,具有一定量的均一細胞懸液,分裝安瓿,標明世代、安瓿號和凍存的日期,保存於液氮中,作爲生產用細胞種子。
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
用生產用細胞種子世代水平或至2/3世代壽命水平的細胞作檢定樣品。用下列動物和雞胚檢查:
乳鼠(24小時內) | 2窩最少 | 10只 |
成鼠 | 12~14g | 10只 |
豚鼠 | 350~500g | 5只 |
家兔 | 1.5~2.5kg | 5只 |
雞胚 | 9~11日齡 | 10只 |
各種動物和雞胚的接種法、觀察期,按照A2.2.2.3條進行。
按A2.3項執行。
檢查用於生產的最後一個世代或其後任一世代,至少檢查500個中期細胞的多倍性、染色體精確計數、斷裂率、結構異常及其他異常發生率,例如螺旋消失或初級次縊痕或次級次縊痕的明顯減弱等。按A2.1.1項進行評價。
生產用細胞庫細胞染色體監測用的染色體標本片和照片,應作爲該細胞批監測此細胞生產疫苗批的記錄,永久保存。
3 生產用細胞的培養
3.1 從生產用細胞種子開始傳代培養,以適宜分種率連續傳代,直至增殖足夠量的細胞培養物用於生產。用於生產的細胞世代,應在細胞整個壽命期的前2/3世代內。
於種毒當天,或在連續傳代種毒,於最後一次細胞種毒當天,此批細胞留取2%~5%不種毒,換維持液作爲正常細胞對照,以檢查外源因子。從換液之日起觀察2周,細胞應無異常變化。
用換維持液0~2天的對照細胞上清液,接種原代兔腎、非人靈長類傳代細胞及另一批人二倍體細胞,接種樣品量應占維持液的20%。觀察14天,換液後5~8天用上清液,在相應細胞盲代一代,觀察14天,做血吸附試驗。
在收毒時,用0.2%~0.5%雞和豚鼠紅細胞,在2~8℃和20~25℃做血吸附試驗,應爲陰性。
3.3 細胞鑑別試驗
在生產用細胞世代水平或其後數代,檢查300個中期細胞,計數多倍體,作100個中期細胞染色體檢查,應核型正常,鑑別確爲本細胞無誤。
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*細胞“世代”的說明:英文是“Population doubling”,簡寫“PD”,譯成“羣體培增”,爲通俗和習慣以名詞“世代”來表示。PD可按實際計數,增加一倍,或按細胞培養面積,增加一倍,爲一個PD,即一個世代。也就是細胞以1:2分種率傳代則爲一個世紀,以1:4分種率傳代則爲2個世代,1:8分種率傳代則爲3個世代。