抗血清

1 拼音

kàng xuè qīng

2 英文參考

antiserum

3 概念

免疫血清亦稱抗血清。含有抗體的血清製劑。

4 抗血清的種類

免疫血清種類很多，包括抗毒素、抗菌血清、抗病毒血清、抗Rh血清等。

（1）抗毒素，將類毒素多次免疫動物（常用馬）後，採取動物的免疫血清，經濃縮純化後製得。主要用於治療細菌外毒素所致疾病。常用的有白喉抗毒素、破傷風抗毒素。

（2）抗菌血清，在本世紀40年代以前曾用抗肺炎、抗百日咳、抗炭疽等抗菌血清治療有關疾病。自從磺胺類藥物和抗生素大量應用後，已極少應用於臨牀治療。但對一些耐藥菌株引起的感染，可用抗菌血清治療。如對綠膿桿菌引起的感染的治療。

（3）抗病毒血清，用病毒免疫動物，取其血清精製而成。目前對病毒病的治療尚缺乏特效藥物。故在某些病毒病的早期或潛伏期，可考慮用抗病毒血清治療。如用抗狂犬病毒血清與抗狂犬疫苗同時對被狂犬嚴重咬傷者進行注射，可防止狂犬病的發生。生。

（4）抗Rh血清，能作用於Rh陽性（Rh）紅細胞，臨牀上常用提純的抗Rh球蛋白預防Rh新生兒溶血症（見Rh免疫球蛋白）。

5 抗血清的製備

5.1 動物的選擇

選擇合適的動物進行免疫極爲重要。選擇時應考慮以直幾個因素：①抗原與免疫動物的種屬差異越遠越好；親緣關係太近不易產生抗體應答（如兔－大鼠之間，雞－鴨之間）。②抗血清量的需要：大動物如馬、騾等可獲得大量血清（一頭成年馬反覆採血可獲得10000ml以上的抗血清）；但有時抗體需要是不多，選用家兔或豚鼠即可。③抗血清的要求：抗血清可分爲R型和H型。H型抗血清用於沉澱反應較難掌握，因而極少應用。④抗原的選擇：對蛋白質抗原，大部分動物皆適合常用的是山羊和家兔。但是，在某些動物體內有類似的物質或其它原因，對這些動物免疫原性極差，如IgE對綿羊、胰島素對家兔、多種酶類（如胃蛋白酶原等）對山羊等，免疫時皆不易出現抗體。這些物質有時可以用豚鼠（如胰島素等）、火雞、甚至豬、狗、貓等作試驗免疫。⑤甾體激素免疫多用家兔；酶類免疫多用豚鼠。

5.2 免疫劑量、時間和途徑

免疫原合適劑量的選定應考慮抗原性強弱、分子量大小和免疫時間。抗原需可量多，時間間隔長，劑量可適當加大。大動物抗原劑量（以蛋白抗原爲準）約0.5～1mg/只，小動物約0.1～0.6mg/只。有時主觀希望加強免疫效果而不適當地加大劑量，往往會弄巧成拙。因爲劑量加大極易造成免疫耐受（免疫抑制）而遭失敗。已有證明，幾微克的蛋白質也能很好地免疫出抗血清。

免疫注射的途徑也很重要。一般採用多點注射，一隻動物注射總數約爲8～10點，包括足掌及肘窩淋巴結周圍，背部兩側、頜下、耳後等處皮內或皮下，皮內易引起細胞免疫反應，對提高抗體效價有利。但皮內注射較困難，特別是天冷時更難注入（因佐劑加入後粘度較大）。其他途徑還有肌內、腹腔、靜脈、腦內等，但較少應用。如抗原極爲寶貴可採用淋巴結內微量注射法，抗原只需10～100μg；方法是先用不完全佐劑在足作基礎免疫（預免疫），10～15天后可見肘窩處有腫大的淋巴結（有時在腹股溝處觸及），用兩手指固定好淋巴結，消毒後用微量注射器直接注射入抗原（一般不需要佐劑）。

免疫間隔時間也是重要因素，特別是首次與第二次之間更應注意。第一次免疫後，因動物機體正處於識別抗原和B細胞增殖階段，如很快接着第二次注入抗原，極易造成免疫抑制。一般以間隔10～20天爲好。二次以後每次的間隔一般爲7～10天，不能太長，以防刺激變弱，抗體效價不高。對於半抗原的免疫間隔則要求較長，有的報告1個月，有的長達40～50天，這是因爲半抗原是小分子，難以刺激機體發生免疫反應之故。免疫的總次數多，多爲5～8次。如爲蛋白質抗原，第八次免疫未獲得抗體，可在30～50天后再追加免疫一次；如仍不產生抗體，則應更換動物。半抗原需經長時間的免疫才能產生高效價抗體，有時總時間爲一年以上。

5.3 動物採血法

動物免疫3～5天后，如抗血清鑑定合格（見下節），應在末次免疫後5～7天及時採血，否則抗體將會下降。因故未及時取血，則應補充免疫一次（肌肉、腹腔或靜脈內注射，不加佐劑），過5～7天取血。

1．頸動脈放血法這是最常用的方法，對家兔、山羊等動物皆可採用。在動物頸外側做皮膚切口，拉開皮膚後可見斜行的胸鎖乳突肌，將此肌鈍性分離並推向後方，即可見到淡紅色有彈性的總動脈。將此動脈輕輕遊離（連同與之同行的迷走神經），用絲線將遠心端結紮，近心端用止血鉗夾住，另一止血鉗夾住動脈迷走神經，用以固定。沿結紮處剪斷血管，用固定止血鉗將斷端放入瓶口，慢慢打開夾持的止血鉗，動脈血立即噴射入瓶。如此放血的速度快，動物死亡也快，取血量略少於其他放血法。如在放血大約總量的一半時，暫時將動脈夾住片刻，再繼續放血，得血量可以多些。

另外一種慢放血法是在動脈內插入一採血器，用閉式放血。在頸動脈內插入一較粗的玻璃管，將血管與玻璃管用線扎牢，玻璃管接一橡皮管引血入瓶，也極爲方便。

2．心臟採血法此法多用於豚鼠、大鼠、雞等小動物。採血技術應熟練，穿刺不準容易導致動物急性死亡。

3．靜脈多次採血法家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次，有時可採集多量血液。如用耳靜脈切開法，一隻家兔可採百餘毫升血液（用頸動脈放血最多可獲70～80ml，一般只有50ml左右）。用頸靜脈採集綿羊血，一次可放300ml，放血後立即回輸10％葡萄糖鹽水，三天後仍可採血200～300ml。動物休息一週，再加強免疫一次，又可採血二次。如此，一隻羊可獲1500～2000ml血液。小鼠取血往往採取斷尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超過2ml。

抗血清的分離多采用室溫自然凝固，然後放置37℃或4℃待凝塊收縮。前者迅速，但得血清較少；後者時間長，有時還會出現溶血，但獲得血清多，而且效價不會下跌。

抗血清分出後是否要經56℃30min滅活有兩種不同意見。一種認爲血清中有許多活性酶，特別是球蛋白的降解酶，如不清除，血清存放過程中將導致抗體效價下降。另外的意見認爲，這種自然降解是微不足道的，56加溫後，有些球蛋白會發生熱變性或者熱聚合。含這種聚合大分子蛋白的抗血清用於免疫濁度試驗時，可因沉澱劑（如PEG）的加入而發生假性混濁。

6 抗血清的鑑定

動物血採集後，立即分離出血清，此抗血清在保存或應用前，必須作效價和特異性鑑定。

6.1 雙向免疫擴散法鑑定抗體的特異性

按雙向免疫擴散技術打兩排孔，上排放抗原粗提物（如抗原來自動物血清則放相應的混合血清）和純化抗原，下排加抗血清，進行雙擴散18～24h後，仔細觀察上下兩排孔之間出現的沉澱線。若與粗抗原及純抗原之間皆出現一條沉澱線，且兩者互相融合，則證明該動物已產生單價特異性抗體；不出現沉澱線，表明示免疫成功。若與純化抗原出現一條，而與粗抗原出現多條線，且其中一條沉澱線與純抗原沉澱線相連接，也是成功的免疫，待取血後將雜抗體吸收去除，可以成爲單價特異性抗體。

6.2 雙向免疫擴散法則定抗血清效價

測定抗血清效價有兩種稀釋方法：一是稀釋抗血清，如1/2、1/4、1/8、1/16對倍稀釋，分別與一個濃度的純抗原反應；另一是稀釋抗原，即把抗原作對倍稀釋或按濃度（如mg/ml）進行稀釋，分別與不同濃度的抗血清進行雙擴散試驗（稱爲棋盤滴定），見表10-1。

表10-1抗血清效價測定

表中＋～＋＋＋代表出現沉澱線的濃度，如1:8抗體出現中等濃度沉澱線，與1:16、1:32則出現較弱的沉澱線。按表10-1的互爲比例稀釋後確定抗血清的效價爲1:32，最佳抗原濃度爲1:16。效價在1:8以上即可採用於一般試驗。

6.3 其他鑑定方法

有時，因抗原特殊，沉澱線不易出現，特別是製備的抗血清將用於某種試驗時，則考慮用其它方法（如血凝試驗、抑制試驗、中和試驗、放射免疫技術等）測定其效價。

7 抗血清的保存

抗血清保存有三種方法。第一種是4℃保存，將抗血清清除菌後，液體狀態保存於普通冰箱，可以存放3個月到半年，效價高時，一年之內不會影響使用。保存時要加入0.1％～0.2％NaN₃以防腐。如若加入半量的甘油則保存期可延長。第二種方法是低溫保存，放在－20～－40，一般保存5年效價不會有明顯下降，但應防止反覆凍融，反覆凍融幾次則效價明顯降低。因此低溫保存應用小包裝，以備取出後在短期內用完。第三種方法是冰凍乾燥，最後製品內水分不應高於0.2％，封裝後可以長期保存，一般在冰箱中5～10年內效價不會明顯降低。

8 抗血清中抗體的純化

單價特異性是指血清只與其特異性抗原發生反應。有時免疫原不純，含有微量的雜抗原（性質相近的），製得的抗血清中出現2～3種雜抗體。即使用純抗原，例如用高度純化的IgG免疫動物，出現的抗體總是有抗γ重鏈的抗體，也有抗κ輕鏈和抗λ輕鏈的抗體。還有一種情況，有些蛋白質和其他蛋白質處於一種結合狀態，如甲胎蛋白常和白蛋白相結合，因此免疫得到的抗血清總是有抗白蛋白雜抗體存在。

8.1 除去雜抗體有兩種方法：

1．親和層析法將交叉雜抗原交聯到瓊脂糖珠4B上，如除去抗白蛋白抗體，則交聯上白蛋白或不含甲胎蛋白的血清，裝柱後，將預吸收的抗體通過親和層析柱，雜抗體吸附在柱上，流出液則是單價特異性抗體。

2．吸附劑方法用不含特異性抗原的抗原液，即不含用於免疫動物抗原的其他雜抗原液，如血清、組織液或已知的某種雜抗原，用雙功能試劑將其交聯，做成固相吸附劑。如用不含甲胎蛋白的血清，稀釋1倍後，加入0.25％的戊二醛或丙酮醛，放冰箱一夜後，該血清成爲膠凍狀，用力打碎（或用組織粉碎器），用緩衝液多次洗滌後，則成爲顆粒狀的凝膠吸附劑。用這種吸附劑直接加到抗血清中（約1/10），抗原則與雜抗體結合，上清液則爲無雜抗體的單價特異性抗體。有時因雜抗體太多，必須處理吸收兩次才能完全去除。吸附過的凝膠，用3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）洗滌，洗脫掉雜抗體，可再繼續使用。

有時雜抗原較少，其他蛋白也少，加入戊二醛後不形成膠凍狀，此時可加入無關蛋白進行交聯，如牛血清蛋白、兔血清、馬血清、卵白蛋白等。加入量以達到含總蛋白的2％～3％爲宜。

8.2 特異性IgG抗體的製備

在標記的免疫測定或其他技術中將特異性抗體純化出來，是極爲重要的。例如在ELISA，用於包被的抗體一定要用特異性IgG，才能得到良好的效果。這是因爲全血清中有大量非抗體蛋白，如白蛋白、α1和α2球蛋白等，如不除去，會干擾包被。再如反相間接血凝，致敏紅細胞的抗體也需用特異性IgG的I（ab＇）₂才能使實驗滿意。特異性IgG和F（ab＇）₂的製備方法有如下幾種。

（一）粗提法提取球蛋白

大多用硫酸銨鹽析法或硫酸鈉鹽析法。硫酸銨鹽析須經過多次沉澱，第一次用40％飽和度，第二次用35％飽和度，第三次用33％飽和度，經三次提取後的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸鈉法更簡便，用20％即可將γ球蛋白沉澱出來。經鹽析後的γ球蛋白雖大多屬於IgG，但還有5％其他區帶蛋白，如γ區的雜蛋白。又因IgG組分中還含其他所謂正常的IgG，產生干擾。因此鹽析法粗提的γ球蛋白只能用於一般的實驗，或者是抗體效價較高的抗血清。

（二）離子交換層析法提取IgG

常用的離子交換劑有DEAE纖維素或QAE纖維素，以QAE-Sephadex最爲理想，DE22、32、52也可應用。取QAE-SephadexA25或A50經酸處理並在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸鹽緩衝液中平衡，將水分抽乾，稱溼重Ig加於10ml血清中，在室溫30min後，離心或過濾除去離子交換劑。上清液再如此處理一次，即獲得較純的IgG，甚至不含其他雜蛋白。用該技術純化IgG簡便，不損壞抗體，既可小量提取，也可大量制備。

（三）親和層析法提取特異性IgG

將純化抗原或粗製抗原（如是單價特異性則對抗原要求不高）交聯Sepharose4B製成親和層析柱，將抗血清過柱後洗去未結合的雜蛋白，再用硫氰酸鉀洗脫，流出的是純的特異性IgG抗體。因硫氰酸鉀對抗體有破壞作用，應及時透析除去。純化的IgG因含量低，失去保護作用，應及時應用或凍幹保存，亦可20℃保存，但皆不理想；加入三乙醇胺或甘油可起保護作用。

（四）酶解法制備F（ab＇）₂片段

胃蛋白酶對IgG的作用點是在連接兩重鏈的二硫鍵靠C端處（232氨基酸處），結果兩個Fab由二硫鍵連接，保留了抗體的結合點。與IgG相比，F（ab＇）₂的特點是去掉了Fc段，這樣在細胞免疫實驗中免除了受體作用；同時也使IgG失去主要的抗原特性，不被抗IgG抗體結合；在反向間接血凝中，用F（ab＇）₂致敏羊紅細胞比用IgG效果好。