1 拼音
2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅲ
色譜法根據其分離原理可分爲：吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與排阻色譜法等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質。分配色譜法是利用被分離物質在兩相中分配係數的不同使組分分離，其中一相被塗布或鍵合在固體載體上，稱爲固定相，另一相爲液體或氣體，稱爲流動相；常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜法是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的樹脂有不同強度的陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂，流動相爲水或含有機溶劑的緩衝液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作爲流動相。
色譜法又可根據分離方法分爲：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。所用溶劑應與供試品不起化學反應，純度要求較高。分離時的溫度，除氣相色譜法或另有規定外，係指在室溫操作。分離後各成分的檢測，應採用各品種項下所規定的方法。採用紙色譜法、薄層色譜法或柱色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分；分離無色物質時，可在短波 （254nm）或長波（365nm）紫外光燈下檢視，其中紙色譜或薄層色譜也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠，採用熒光猝滅法檢視。柱色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測器檢測。柱色譜法還可分部收集流出液後用適宜方法測定。
2 附錄Ⅲ A 紙色譜法
紙色譜法系以紙爲載體，以紙上所含水分或其他物質爲固定相，用展開劑進行展開的分配色譜。供試品經展開後，可用比移值（Rf）表示其各組成成分的位置（比移值=原點中心至斑點中心的距離/原點中心至展開劑前沿的距離）。由於影響比移值的因素較多，因而一般採用在相同實驗條件下與對照物質對比以確定其異同。用作藥品鑑別時，供試品在色譜圖，中所顯主斑點的位置與顏色（或熒光），應與對照品在色譜圖中所顯主斑點相同。用作藥品純度檢查時，可取一定量的供試品，經展開後，按各品種項下的規定，檢視其所顯雜質斑點的個數或呈色深度（或熒光強度）。進行藥品含量測定時，將色譜主斑點剪下經洗脫後，再用適宜的方法測定。
2.1 1．儀器與材料
2.1.1 （1）展開容器
通常爲圓形或長方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃蓋，應能密閉。用於下行法時，蓋上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展開劑。在近頂端有一用支架架起的玻璃槽作爲展開劑的容器，槽內有一玻棒，用以壓住色譜濾紙；槽的兩側各支一玻棒，用以支持色譜濾紙使其自然下垂。用於上行法時，在蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤，以便將點樣後的色譜濾紙掛在鉤上；併除去溶劑槽和支架。
2.1.2 （2）點樣器
常用具支架的微量注射器或定量毛細管，應能使點樣位置正確、集中。
2.1.3 （3）色譜濾紙
應質地均勻平整，具有一定機械強度，不含影響展開效果的雜質；也不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑑別效果，必要時可進行處理後再用。用於下行法時，取色譜濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條，離紙條上端適當的距離（使色譜濾紙上端能足夠浸入溶劑槽內的展開劑中，並使點樣基線能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數釐米處）用鉛筆劃一點樣基線，必要時，可在色譜濾紙下端切成鋸齒形便於展開劑滴下。用於上行法時，色譜濾紙長約25cm，寬度則按需要而定，必要時可將色譜濾紙捲成筒形；點樣基線距底邊約2.5cm。
2.2 2．操作方法
2.2.1 （1）下行法
將供試品溶解於適宜的溶劑中製成一定濃度的溶液。用定量毛細管或微量注射器吸取溶液，點於點樣基線上，溶液宜分次點加，每次點加後，俟其自然乾燥、低溫烘乾或經溫熱氣流吹乾，樣點直徑爲2～4mm，點間距離約爲1.5～2.0cm，樣點通常應爲圓形。將點樣後的色譜濾紙的點樣端放在溶劑槽內並用玻棒壓住，使色譜濾紙通過槽側玻璃支持棒自然下垂，點樣基線在支持棒下數釐米處。展開前，展開缸內用各品種項下規定的溶劑的蒸氣使之飽和，一般可在展開缸底部放一裝有規定溶劑的平皿或將被規定溶劑潤溼的濾紙條附着在展開缸內壁上，放置一定時間，俟溶劑揮發使缸內充滿飽和蒸氣。然後小心添加展開劑至溶劑槽內，使色譜濾紙的上端浸沒在槽內的展開劑中。展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙移動進行展開，展開至規定的距離後，取出色譜濾紙，標明展開劑前沿位置，俟展開劑揮散後按規定方法檢測色譜斑點。
2.2.2 （2）上行法
點樣方法同下行法。展開缸內加入展開劑適量，放置俟展開劑蒸氣飽和後，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入展開劑約0.5cm，展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙上升，除另有規定外，一般展開至約15cm後，取出晾乾，按規定方法檢視。
展開可以單向展開，即向一個方向進行；也可進行雙向展開，即先向一個方向展開，取出，俟展開劑完全揮發後，將濾紙轉動90°,再用原展開劑或另一種展開劑進行展開；亦可多次展開、連續展開或徑向展開等。
3 附錄Ⅲ B 高效液相色譜法
高效液相色譜法系採用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各組分在柱內被分離，並依次進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。
3.1 1．對儀器的一般要求和色譜條件
所用的儀器爲高效液相色譜儀。儀器應定期檢定並符合有關規定。
3.1.1 （1）色譜柱
反相色譜系統使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑爲化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最爲常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。
填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行爲和分離效果。分析分子量小於2000的化合物應選擇孔徑在15nm（1nm=10A）以下的填料，分析分子量大於2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。
除另有規定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更小（約2μm）的填充劑常用於填裝微徑柱（內徑約2mm）。
使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種項下規定的色譜條件的測定結果爲準。
以硅膠爲載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，爲改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。
流動相的pH值應控制在2～8之間。當pH值大於8時，可使載體硅膠溶解；當pH值小於2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH值大於8的流動相時，應選用耐鹼的填充劑，如採用高純硅膠爲載體並具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機－無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用pH值小於2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機－無機雜化填充劑等。
3.1.2 （2）檢測器
最常用的檢測器爲紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。
紫外、熒光、電化學檢測器爲選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；蒸發光散射檢測器和示差折光檢測器爲通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用於供試品的光譜鑑定和色譜峯的純度檢查。
紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定範圍內呈線性關係，但蒸發光散射檢測器的響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數關係，故進行計算時，一般需經對數轉換。
不同的檢測器，對流動相的要求不同。如採用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外－可見分光光度法（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A）項下對溶劑的要求；採用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，並選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發性鹽組分的流動相。
3.1.3 （3）流動相
反相色譜系統的流動相首選甲酵－水系統（採用紫外末端波長檢測時，首選乙腈－水系統），如經試用不適合時，再選用其他溶劑系統。應儘可能少用含有緩衝液的流動相，必須使用時，應儘可能選用含較低濃度緩衝液的流動相。由於C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對於十八烷基硅烷鍵合硅膠爲固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低於5%．否則C18鏈的隨機捲曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。
各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品並達到系統適用性試驗的要求。其中，調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小於或等於50%）相對於自身的改變量不超過±30%且相對於總量的改變量不超過±10%爲限，如30%相對改變量的數值超過總量的10%時，則改變量以總量的±10%爲限。
對於必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。
3.2 2．系統適用性試驗
色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重複性和拖尾因子等四個參數。其中，分離度和重複性尤爲重要。
按各品種項下要求對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，必要時，可對色譜系統進行適當調整，以符合要求。
3.2.1 （1）色譜柱的理論板數（n）
用於評價色譜柱的分離效能。由於不同物質在同一色譜柱上的色譜行爲不同，採用理論板數作爲衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般爲待測組分或內標物質的理論板數。
在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峯或內標物質峯的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和峯寬（W）或半高峯寬（Wh/2），按n=16 （tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數。
3.2.2 （2）分離度（R）
用於評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度，對色譜系統進行評價與控制。
無論是定性鑑別還是定量分析，均要求待測峯與其他峯、內標峯或特定的雜質對照峯之間有較好的分離度。除另有規定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大於1.5。分離度的計算公式爲：
式中 tR2爲相鄰兩峯中後一峯的保留時間；
tR1爲相鄰兩峯中前一蜂的保留時間；
W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別爲此相鄰兩峯的峯寬及半高峯寬（如圖）。
當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峯寬（W）的計算結果爲準。
3.2.3 （3）重複性
用於評價連續進樣中，色譜系統響應值的重複性能。採用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峯面積測量值的相對標準偏差應不大於2.0%；採用內標法時，通常配製相當於80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大於2.0%。
（4）拖尾因子（T） 用於評價色譜峯的對稱性。爲保證分離效果和測量精度，應檢查待測峯的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式爲：
式中W0.05h爲5%峯高處的峯寬；
d1爲峯頂點至峯前沿之間的距離（如圖）。
除另有規定外，峯高法定量時T虛在0.95～1.05之間。峯面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峯面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規定。
3.3 3．測定法
3.3.1 （1）內標法
按各品種頊下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峯面積或峯高，按下式計算校正因子：
式中AS爲內標物質的峯面積或峯高；
AR爲對照品的峯面積或峯高；
CS爲內標物質的濃度；
CR爲對照品的濃度。
再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峯面積或峯高，按下式計算含量：
式中 AX爲供試品的峯面積或峯高；
cX爲供試品的濃度；
A'S爲內標物質的峯面積或峯高；
C'S爲內標物質的濃度；
f爲校正因子。
採用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。
3.3.2 （2）外標法
按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配製成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峯面積（或峯高），按下式計算含量：
式中各符號意義同上。
由於微量注射器不易精確控制進樣量，當採用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環或自動進樣器進樣爲好。
3.3.3 （3）加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質含量時，可採用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配製測定雜質校正因子的溶液，選樣，記錄色譜圖，接上述（1）法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用於校正雜質的實測峯面積。這些需作校正計算的雜質，通常以主成分爲參照，採用相對保留時間定位，其數值一併載入各品種項下。
測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作爲對照溶液，進樣，調節檢測靈敏度（以噪聲水平可接受爲限）或進樣量（以柱子不過載爲限），使對照溶液的主成分色譜峯的峯高約達滿量程的10%～25%或其峯面積能準確積分[通常含量低於0.5%的雜質，峯面積的相對標準偏差（RSD）應小於10%；含量在0.5%～2%的雜質，峯面積的RSD應小於5%;含量大於2%的雜質，峯面積的RSD應小於2%]。然後，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規定外，應爲主成分色譜峯保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峯面積，分別乘以相應的校正因子後與對照溶液主成分的峯面積比較，依法計算各雜質含量。
3.3.4 （4）不加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可採用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配製對照溶液並調節檢測靈敏度後，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規定外，應爲主成分色譜峯保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峯面積並與對照溶液主成分的峯面積比較，計算雜質含量。
若供試品所含的部分雜質未與溶劑峯完全分離，則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峯的總面積（包括溶劑峯），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峯面積，即爲總雜質峯的校正面積。然後依法計算。
3.3.5 （5）面積歸一化法
按備品種項下的規定，配製供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峯的面積和色譜圖上除溶劑峯以外的總色譜峯面積，計算各峯面積佔總峯面積的百分率。用於雜質檢查時，由於峯面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只用於粗略考查供試品中的雜質含量。除另有規定外，一般不宜用於微量雜質的檢查。
4 附錄Ⅲ C 氣相色譜法
氣相色譜法系採用氣體爲流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先後進入檢測器，用數據處理系統記錄色譜信號。
4.1 1．對儀器的一般要求
所用的儀器爲氣相色譜儀，由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統等組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均應根據分析要求適當設定。
4.1.1 （1）載氣源
氣相色譜法的流動相爲氣體，稱爲載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供，經過適當的減壓裝置，以一定的流速經過進樣器和色譜柱；根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣，除另有規定外，常用載氣爲氮氣。
4.1.2 （2）進樣部分
進樣方式一般可採用溶液直接進樣、自動進樣或頂空進樣。
溶液直接進樣採用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣；採用溶液直接進樣或自動進樣時，進樣口溫度應高於柱溫30～50℃；進樣量一般不超過數微升；柱徑越細，進樣量應越少；採用毛細管柱時，一般應分流，以免過載。
頂空進樣適用於固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品製成供試液後，置於密閉小瓶中，在恆溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在液態和氣態達到平衡後，由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。
4.1.3 （3）色譜柱
色譜柱爲填充柱或毛細管柱。填充柱的材質爲不鏽鋼或玻璃，內徑爲2～4mm，柱長爲2～4m，內裝吸附劑、高分子多孔小球或塗漬固定液的載體，粒徑爲0.18～0.25mm、0.15～0.18mm或0.125～0.15mm。常用載體爲經酸洗並硅烷化處理的硅藻土或高
分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質爲玻璃或石英，內壁或載體經塗漬或交聯固定液，內徑一般爲0.25mm、0.32mm或0.53mm，柱長5～60m，固定液膜厚0.1～5.0μm，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。
新填充柱和毛細管柱在使用前需老化處理，以除去殘留溶劑及易流失的物質，色譜柱如長期未用，使用前應老化處理，使基線穩定。
4.1.4 （4）柱溫箱
由於柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性，因此柱溫箱控溫精度應在±1℃，且溫度波動小於每小時0.1℃。溫度控制系統分爲恆溫和程序升溫兩種。
4.1.5 （5）檢測器
適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器（FID）、熱導檢測器（TCD）、氮磷檢測器（NPD）、火焰光度檢測器（FPD）、電子捕獲檢測器（ECD）、質譜檢測器（MS）等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好，適合檢測大多數的藥物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適於含鹵素的化合物；質譜檢測器還能給出供試品某個成分相應的結構信息，可用於結構確證。除另有規定外，一般用火焰離子化檢測器，用氫氣作爲燃氣，空氣作爲助燃氣。在使用火焰離子化檢測器時，檢測器溫度一般應高於柱溫，並不得低於150℃，以免水汽凝結，通常爲250～350℃。
4.1.6 （6）數據處理系統
可分爲記錄儀、積分儀以及計算機工作站等。
各品種項下規定的色譜條件，除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、載體牌號、粒度、固定液塗布濃度、載氣流速、柱溫一進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種並符合系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於30分鐘內記錄完畢。
4.2 2．系統適用性試驗
除另有規定外，應照高效液相色譜法（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B）項下的規定。
4.3 3.測定法
（1）內標法
（2）外標法
（3）面積歸一化法
上述（1）～（3）法的具體內容均同高效液相色譜法（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B）項下相應的規定。
（4）標準溶液加入法 精密稱（量）取某個雜質或待測成分對照品適量，配製成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定雜質或主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品溶液中某個雜質和主成分含量。
也可按下述公式進行計算，加入對照品溶液前後校正因子應相同，即：
則待測組分的濃度cX可通過如下公式進行計算：
式中 cX爲供試品中組分X的濃度；
AX爲供試品中組分X的色譜峯面積；
△cX爲所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度；
Ais爲加入對照品後組分X的色譜峯面積。
由於氣相色譜法的進樣量一般僅數微升，爲減小進樣誤差，尤其當採用手工進樣時，由於留針時間和室溫等對進樣量也有影響，故以採用內標法定量爲宜；當採用自動進樣器對，由於進樣重複性的提高，在保證分析誤差的前提下，也可採用外標法定量。當採用頂空進樣時，由於供試品和對照品處於不完全相同的基質中，故可採用標準溶液加入法以消除基質效應的影響；當標準溶液加入法與其他定量方法結果不一致時，應以標準加入法結果爲準。
5 附錄Ⅲ D 分子排阻色譜法
分子排阻色譜法是根據待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術。分子排阻色譜法的分離原理爲凝膠色譜柱的分子篩機制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經修飾凝膠如葡聚糖凝膠（Sephadex）和聚丙烯酰胺凝膠（Sepharose）等爲填充劑，這些填充劑表面分佈着不同尺寸的孔徑，藥物分子進入色譜柱後，它們中的不同組分按其分子大小進入相應的孔徑內，大於所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內部，在色譜過程中不被保留，最早被流動相洗脫至柱外，表現爲保留時間較短；小於所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在色譜桂中滯留時間較長，表現爲保留時間較長；其餘分子則按分子大小依次被洗脫。
5.1 1．對儀器的一般要求
分子排阻色譜法所需的進樣器和檢測器同高效液相色譜法，液相色譜泵一般分常壓、中壓和高壓。在藥物分析中，尤其是分子量或分子量分佈測定中，通常採用高效分子排阻色譜法（HPSEC）。應選用與供試品分子大小相適應的色譜柱填充劑。使用的流動相通常爲水溶液或緩衝液，溶液的pH值不宜超出填充劑的耐受力，一般pH值在2～8範圍。流動相中可加入適量的有機溶劑，但不宜過濃，一般不應超過30%，流速不宜過快，一般爲0.5～1.0ml/min。
5.2 2．系統適用性試驗
高效分子排阻色譜法的系統適用性試驗中色譜柱的理論板數（n）、分離度、重複性、拖尾因子的測定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法項下方法，但在高分
子雜質檢查時，某些藥物分子的單體與其二聚體不能達到基線分離時，其分離度的計算公式爲：
5.3 3．測定法
5.3.1 （1）分子量測定法
一般適用於蛋白質和多肽的分子量測定。按各品種項下規定的方法，選用與供試品分子大小相適宜的色譜柱和適宜分子量範圍的對照品，除另有規定外，對照品與供試品均需使用二硫蘇糖醇（DTT）和十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，以打開分子內和分子間的二硫鍵，並使分子的構型與構象趨於一致，經處理的蛋白質和多肽分子通常以線性形式分離，以對照品分子量（Mw）的對數值對相應的保留時間（tR）製得標準曲線的線性迴歸方程lgMw=α+btR，供試品以保留時間由標準曲線迴歸方程計算其分子量或亞基的分子量。
5.3.2 （2）生物大分子聚合物分子量與分子量分佈的測定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等具有分子大小不均一的特點，故生物大分子聚合物分子量與分子量分佈是控制該類產品的關鍵指標。在測定生物大分子聚合物分子量與分子量分佈時，選用與供試品分子結構與性質相同或相似的對照品十分重要。
按各品種項下規定的方法，除另有規定外，同樣採用分子量對照品和適宜的GPC軟件，以對照品重均分子量（Mw）的對數值對相應的保留時間（tR）製得標準曲線的線性迴歸方程lgMw=a+btR，供試品採用適宜的GPC軟件處理結果，並按下列公式計算出供試品的分子量與分子量分佈。
D爲分佈係數；
RIi爲供試品在保留時間i時的峯高；
Mi爲供試品在保留時間i時的分子量。
5.3.3 （3）高分子雜質測定法
高分子雜質係指供試品中含有分子量大於藥物分子的雜質，通常是藥物在生產或貯存過程中產生的高分子聚合物或在生產過程中未除盡的可能產生過敏反應的高分子物質。
定量方法
①主成分自身對照法 同高效液相色譜法項下規定。一般用於高分子雜質含量較低的品種。
③限量法 除另有規定外，規定不得檢出保留時間小於對照品保留時間的組分，一般用於混合物中高分子物質的控制。
④自身對照外標法 一般用於Sephadex G-10凝膠色譜系統中β-內酰胺抗生素中高分子雜質的檢查。在該分離系統中，除部分寡聚物外，β-內酰胺抗生素中高分子雜質在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質表現爲單一的色譜峯，以供試品自身爲對照品，按外標法計算供試品中高分子雜質的相對百分含量。
【附註】 Sephadex G-10的處理方法
色譜柱的填裝 裝柱前先將約15g葡聚糖凝膠Sephadex G-l0用水浸泡48小時，使之充分溶脹，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入玻璃柱，一次性裝填完畢，以免分層，然後用水將附着玻璃管壁的Sephadex G-10洗下，使色譜柱面平整，新填裝的色譜柱要先用水連續沖洗4～6小時，以排出柱中的氣泡。
供試品的加入 進樣可以採用自動進樣閥，也可以直接將供試品加在牀的表面（此時，先將牀表面的流動相吸乾或滲幹，立即將供試品溶液沿着色譜管壁轉圈緩緩加入，注意勿使填充劑翻起，待之隨着重力的作用滲入固定相後，再沿着色譜管壁轉圈緩緩加入3～5ml流動相，以洗下殘留在色譜管壁的供試品溶液）。
6 附錄Ⅲ E 離子色譜法
離子色譜法系採用高壓輸液泵系統將規定的洗脫液泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜分析方法。注入的供試品由洗脫液帶入色譜柱內進行分離後，經過抑制器或衍生系統進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。離子色譜法常用於無機陰離子、無機陽離子、有機酸、糖醇類、氨基糖類、氨基酸、蛋白質、糖蛋白等物質的定性和定量分析。它的分離機理主要爲離子交換，即基於離子交換樹脂上可解離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子之間進行的可逆交換；離子色譜法的其他分離機理還有形成離子對、離子排阻等。
6.1 1．對儀器的一般要求
離子色譜儀器中所有與洗脫液或供試品接觸的管道、器件均應使用惰性材料，如聚醚醚酮（PEEK）等。儀器應定期檢定並符合有關規定。
6.1.1 （1）色譜柱
離子交換色譜的色譜柱填充劑有兩種，分別是有機聚合物載體填充劑和無機載體填充劑。
有機聚合物載體填充劑最爲常用，填充劑的載體一般爲苯乙烯－二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯－二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有機聚合物。這類載體的表面通過離子鍵附聚了大量具有陰離子交換功能基（如烷基季銨基、烷醇季銨基等）或陽離子交換功能基（如磺酸、羧酸、羧酸－膦酸和羧酸－膦酸冠醚等）的乳膠微粒，可分別用於陰離子或陽離子的交換分離。有機聚合物載體填充劑在較寬的酸鹼範圍（pH0～14）內具有較高的穩定性，且有一定的耐有機溶劑腐蝕性。
無機載體填充劑一般以硅膠爲載體。在硅膠表面的硅醇基通過化學鍵合季銨基等陰離子交換功能基或磺酸基、羧酸基等陽離子交換功能基，可分別用於陰離子或陽離子的交換分離。硅膠載體填充劑機械穩定性好、在有機溶劑中不會溶脹或收縮。硅膠載體填充劑在pH2～8的洗脫液中穩定，一般適用於陽離子樣品的分離。
6.1.2 （2）洗脫液
離子色譜對複雜樣品的分離主要依賴於色譜柱的填充劑，而洗脫液相對較爲簡單。分離陰離子常採用稀鹼溶液、碳酸鹽緩衝液等作爲洗脫液；分離陽離子常採用稀甲烷磺酸溶液等作爲洗脫液。通過增加或減少洗脫液中酸鹼溶液的濃度可提高或降低洗脫液的洗脫能力；在洗脫液內加入適當比例的有機改性劑，如甲醇、乙腈等可改善色譜峯峯形。製備洗脫液的去離子水應經過純化處理，電導率一般小於0.056μS/cm。使用的洗脫液需經脫氣處理，常採用氦氣在線脫氣的方法，也可採用超聲、減壓過濾或冷凍的方式進行離線脫氣。
6.1.3 （3）檢測器
電導檢測器是離子色譜常用的檢測器，其他檢測器有紫外檢測器、安培檢測器、蒸發光散射檢測器等。
電導檢測器主要用於測定無機陰離子、無機陽離子和部分極性有機物，如羧酸等。離子色譜法中常採用抑制型電導檢測器，即使用抑制器將具有較高電導率的洗脫液在進入檢測器之前中和成具有極低電導率的水或其他較低電導率的溶液，從而顯著提高電導檢測的靈敏度。安培檢測器用於分析解離度低，但具有氧化或還原性質的化合物。直流安培檢測器可以測定碘離子（I-）、硫氰酸根離子（SCN-）和各種酚類化合物等。積分安培檢測器和脈衝安培檢測器則常用於測定糖類和氨基酸類化合物。
紫外檢測器適用於在高濃度氯離子等存在下痕量的溴離子（Br-）、亞硝酸根離子（NO2-）、硝酸根離子（NO3-）以及其他具有強紫外吸收成分的測定。柱後衍生－紫外檢測法常用於分離分析過渡金屬離子和鑭系金屬等。蒸發光散射、原子吸收、原子發射光譜、電感耦合等離子體原子發射光譜、質譜（包括電感耦合等離子體質譜）也可作爲離子色譜的檢測器。離子色譜在與蒸發光散射檢測器或（和）質譜檢測器等聯用時，一般採用帶有抑制器的離子色譜系統。
6.2 2．樣品處理
離子色譜法的色譜柱填充劑大多數不兼容有機溶劑，一旦污染後不能用有機溶劑清洗，所以離子色譜法對樣品處理的要求較高。對於基質簡單的澄清水溶液一般通過稀釋和0.45μm濾膜過濾後直接進樣分析。對於基質複雜的樣品，可通過微波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干擾物後進樣分析。
6.3 3．系統適用性試驗
照高效液相色譜法（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B）項下相應的規定。
6.4 4．測定法
（1）內標法
（2）外標法
（3）面積歸一化法
上述（1）～（3）法的具體內容均同高效液相色譜法（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B）項下相應的規定。
（4）標準曲線法 按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品適量配製成貯備溶液。分別量取貯備溶液配製成一系列梯度濃度的對照溶液。量取上述梯度濃度的對照品溶液各適量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液中待測組分的峯面積或峯高。以標準溶液的峯面積或峯高爲縱座標，以標準溶液的濃度爲橫座標，迴歸計算標準曲線，其公式爲：
AR=a×CR+b
CR爲對照溶液的濃度；
a爲標準曲線的斜率；
b爲標準曲線的截距。
再取各品種項下供試品溶液，注入色譜儀，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分（或其雜質）的峯面積或峯高。按下式計算其濃度：
CS爲供試品溶液的濃度；
a、b符號的意義同上。
上述測定法中，以外標法和標準曲線法最爲常用。