2 英文參考
thin-layer chromatography (TLC)[朗道漢英字典]
thin layer chromatography[21世紀雙語科技詞典]
TLC[朗道漢英字典]
plate chromatography[湘雅醫學專業詞典]
thin layer chromonere[湘雅醫學專業詞典]
3 概述
薄層色譜法亦稱薄層層析法。是將吸附劑或載體均勻地鋪在玻璃板、塑料板或鋁基片上形成一均勻薄層,待點樣、展開後,與適宜的對照物按同法在同板上所得的色譜圖對比,並可用薄層掃描儀進行掃描,用以進行藥品的鑑別,雜質檢查或含量測定的方法。按分離機制可分爲吸附、分配、離子交換、凝膠過濾等法。適用於微量樣品的分離鑑定,具有分離速度快,分離效率高的特點。
5 薄層色譜法的儀器與材料
5.1 薄層板
自制薄層板 除另有規定外,玻璃板要求光滑、平整,洗淨後不附水珠,晾乾。最常用的固定相有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H和硅膠HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F254等。其顆粒大小,一般要求粒徑爲5~40μm。
薄層塗布,一般可分爲無黏合劑和含黏合劑兩種。前者系將固定相直接塗布於玻璃板上,後者系在固定相中加入一定量的黏合劑,一般常用10%~15%煅石膏(CaSO4·2H2O在140℃加熱4小時),混勻後加水適量使用,或用羧甲基纖維素鈉水溶液(0.2%~0.5%)適量調成糊狀,均勻塗布於玻璃板上。使用塗布器塗布應能使固定相在玻璃板上塗成一層符合厚度要求的均勻薄層。
市售薄層板 分普通薄層板和高效薄層板,如硅膠薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜和鋁基片薄層板等。高效薄層板的粒徑一般爲5~7μm。
5.2 點樣器
常用具支架的微量注射器或定量毛細管,應能使點樣位置正確、集中。
5.3 展開容器
應使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸,並有嚴密的蓋子,底部應平整光滑,或有雙槽。
5.4 顯色劑
見各品種項下的規定。可採用噴霧顯色、浸漬顯色或置適宜試劑的蒸氣中燻蒸顯色,用以檢出斑點。
5.5 顯色裝置
噴霧顯色要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻
細霧狀噴出;浸漬顯色可用專用玻璃器皿或用適宜的玻璃缸代替;蒸氣燻蒸顯色可用雙槽玻璃缸或適宜大小的乾燥器代替。
5.6 檢視裝置
檢視裝置爲裝有可見光、短波紫外光(254nm)、長波紫外光(365nm)光源及相應濾片的暗箱,可附加攝像設備供拍攝色譜用,暗箱內光源應有足夠的光照度。
6 薄層色譜法的操作方法
6.1 薄層板製備
自制薄層板 除另有規定外,將1份固定相和3份水在研鉢中按同一方向研磨混合,去除表面的氣泡後,倒入塗布器中,在玻璃板上平穩地移動塗布器進行塗布(厚度爲0.2~0.3mm),取下塗好薄層的玻璃板,置水平臺上於室溫下晾乾後,在110℃活化30分鐘,即置有乾燥劑的乾燥箱中備用。使用前檢查其均勻度(可通過透射光和反射光檢視)。
市售薄層板 臨用前一般應在110℃活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板可根據需要剪裁,但須注意剪裁後的薄層板底邊的硅膠層不得有破損。如在貯放期間被空氣中雜質污染,使用前可用適宜的溶劑在展開容器中上行展開預洗,110℃活化後,置乾燥器中備用。
6.2 點樣
除另有規定外,用點樣器點樣於薄層板上,一般爲圓點,點樣基線距底邊2.0cm,樣點直徑爲2~4mm(高效薄層板爲1~2mm),點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出爲宜,一般爲1.0~2.0cm(高效薄層板可不小於5mm)。點樣時必須注意勿損傷薄層板表面。
6.3 展開
展開缸如需預先用展開劑飽和,可在缸中加入足夠量的展開劑,必要時在壁上貼兩條與缸一樣高、寬的濾紙條,一端浸入展開劑中,密封頂蓋,使系統平衡或按各品種項下的規定操作。
將點好供試品的薄層板放入展開缸中,浸入展開劑的深度爲距薄層板底邊0.5~1.0cm(切勿將樣點浸入展開劑中),密封頂蓋,待展開至適宜的展距(如:20cm的薄層板,展距一般爲10~15cm;10cm的高效薄層板,展距一般爲5cm左右),取出薄層板,晾乾,按各品種項下的規定檢測。
展開可以單向展開,即向一個方向進行;也可以進行雙向展開,即先向一個方向展開,取出,待展開劑完全揮發後,將薄層板轉動90°,再用原展開劑或另一種展開劑進行展開;亦可多次展開。
6.4 顯色與檢視
熒光薄層板可用熒光猝滅法;普通薄層板,有色物質可直接檢視,無色物質可用物理或化學方法檢視。物理方法是檢出斑點的熒光顏色及強度;化學方法一般用化學試劑顯色後,立即覆蓋同樣大小的玻璃板,檢視。
7 系統適用性試驗
按各品種項下要求對檢測方法進行薄層色譜法系統適用性試驗,使斑點的檢測靈敏度、比移值(Rf)和分離效能符合規定。
7.1 檢測靈敏度
係指雜質檢查時,供試品溶液中被測物質能被檢出的最低量。一般採用對照溶液稀釋若干倍的溶液與供試品溶液和對照溶液在規定的色譜條件下,在同一塊薄層板上點樣、展開、檢視,前者應顯示清晰的斑點。
7.2 比移值(Rf)
係指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值。鑑別時,可用供試品溶液主斑點與對照品溶液主斑點的比移值進行比較,或用比移值來說明主斑點或雜質斑點的位置。
除另有規定外,比移值(Rf)應在0.2~0.8之間。
7.3 分離效能
鑑別時,在對照品與結構相似藥物的對照品製成混合對照溶液的色譜圖中,應顯示兩個清晰分離的斑點。雜質檢查的方法選擇時,可將雜質對照品用供試品自身稀釋對照溶液溶解製成混合對照溶液,也可將雜質對照品用待測組分的對照品溶液溶解製成混合對照溶液,還可採用供試品以適當的降解方法獲得的溶液,上述溶液點樣展開後的色譜圖中,應顯示兩個清晰分離的斑點。
8 測定法
8.1 鑑別
薄層色譜法用於鑑別時,可採用與同濃度的對照品溶液,在同一塊薄層板上點樣、展開與檢視,供試品溶液所顯主斑點的顏色(或熒光)與位置(Rf)應與對照品溶液的主斑點一致,而且主斑點的大小與顏色的深淺也應大致相同。或採用供試品溶液與對照品溶液等體積混合,應顯示單一、緊密的斑點;或選用與供試品化學結構相似的藥物對照品與供試品溶液的主斑點比較,兩者Rf應不同,或將上述兩種溶液等體積混合,應顯示兩個清晰分離的斑點。
8.2 雜質檢查
薄層色譜法用於雜質檢查時,可採用雜質對照品法、供試品溶液的自身稀釋對照法,或兩法並用。供試品溶液除主斑點外的其他斑點應與相應的雜質對照品溶液或系列濃度雜質對照品溶液的相應主斑點比較,或與供試品溶液的自身稀釋對照溶液或系列濃度自身稀釋對照溶液的相應主斑點比較,不得更深。
9 薄層掃描法
係指用一定波長的光照射在薄層板上,對薄層色譜有吸收紫外光或可見光的斑點,或經激發後能發射出熒光的斑點進行掃描,將掃描得到的圖譜及積分數據用於藥品的鑑別,雜質檢查或含量測定。
除另有規定外,薄層掃描方法可根據各種薄層掃描儀的結構特點及使用說明,結合具體情況,選擇反射方式,採用吸收法,或熒光法,用雙波長或單波長掃描。測定方法有內標法及外標法,由於影響薄層掃描結果的因素很多,故薄層掃描定量測定應在保證供試品斑點的量在校正曲線的線性範圍內的情況下,與對照品同板點樣,展開,掃描,測量和計算。
用外標法測定時,若對照品各數據點在校正曲線上呈一通過原點的直線時,可用一點法校正,如不通過原點通常宜採用二點法校正,必要時用多點法校正。含量測定時,供試品溶液和對照品溶液應交叉點於同一薄層板上,供試品點樣不得少於4個,對照品每一濃度不得少於2個,薄層掃描定量用的對照品純度應符合含量測定用對照品的要求。
10 參考資料
- ^ [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版:二部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.