4 藥典標準
4.1 藥品名稱
4.2 拼音名
Xifu Jingzhi Baihou Leidusu
4.3 英文名
ADSORBED PURIFIED DIPHTHERIA TOXOID
4.4 來源(分子式)與標準
本品系用白喉桿菌菌種，在適宜的培養基中培養產生的毒素，經甲醛解毒精製並加 入磷酸鋁或氫氧化鋁等適宜的吸附劑製成。每1ml 中含白喉類毒素30～50個絮狀單位。
4.5 性狀
本品爲乳白色均勻混懸液；放置過久，吸附劑下沉，溶液上層應澄明無 色，經振搖能均勻分散。
4.6 檢查
照《中國生物製品》中吸附精製白喉類毒素製造及檢定規程的各項規定 進行試驗，均應符合規定。
4.7 類別
生物製品。
4.8 劑量
皮下注射2 次，每次0.5ml ，間隔4 ～8 周，一年後再注射 1次。
4.9 注意
4.10 貯藏
在 2～8 ℃的暗處保存。
5 吸附精製白喉類毒素製造及檢定規程
5.1 毒素製造
1.1菌種
1.1.1 應選用中國藥品生物製品檢定所分發或同意的白喉桿菌PW8株，或經由PW8株篩選的產毒高、免疫力強的菌種。必要時可對菌種進行篩選。
1.1.2 菌種宜用凍幹法保存。亦可用血清斜面或產毒培養基傳代保存，但代數不宜過多。
1.2 培養基
宜用胰酶牛肉消化液培養基或其他適宜培養基，但不得采用馬肉或其他馬體組織，應儘量減少對人體引起過敏反應的物質，不應含有可以引起人體毒性反應的物質。
1.3 毒素
1.3.1 毒素製造過程應嚴格控制雜菌污染。凡經鏡檢或純菌試驗發現污染者應廢棄。
1.3.3培養物加甲醛溶液或甲苯殺菌後進行精製或過濾後進行脫毒。所用化學原料應符合《中國生物製品主要原材料試行標準》。
5.2 精製
2.1毒素或類毒素可採用硫酸銨活性炭二段鹽析法或其他適宜方法精製。
2.3精製過程應避免染菌，透析過程可加適量防腐劑，有肉眼可見染菌者應廢棄。
2.4 化學原料等級應不低於化學純。
2.5用同一菌種、培養基處方、精製方法製造的類毒素在同一容器內混合均勻後除菌過濾者爲1批。除菌不徹底者可重濾。
5.3 類毒素製造
3.2 毒素或精製毒素中加入適量的甲醛溶液，置適宜溫度進行脫毒。精製毒素亦可加適量賴氨酸後再加甲醛脫毒。所用化學原科等級不應低於化學純。
3.3 脫毒試驗
每瓶類毒素或精製類毒素取樣，用滅菌生理鹽水分別稀釋至100Lf/ml，用體重2.0kg左右的家兔2只，每隻動物分別皮內注射上述稀釋樣品各0.1ml及25倍稀釋的錫克毒素0.1ml,於96小時判定結果。樣品注射部位須無反應或僅有幾無可量的反應，錫克反應須爲陽性。
3.4 脫毒不完全者可繼續脫毒，必要時可補加適量甲醛溶液。
3.6 毒性逆轉試驗
每瓶精製類毒素取樣，用pH7.0～7.4磷酸鹽緩衝鹽水分別稀釋至30～50Lf/ml，置37℃20～30天，用體重2.0kg左右的家兔2只，每隻家兔分別皮內注射上述稀釋樣品各0.1ml及25倍稀釋的錫克毒素0.1ml，於72小時判定結果。樣品注射部位紅腫反應直徑不應超過15mm，錫克反應須爲陽性。
3.7 精製類毒素應加0.01%(g/ml)硫柳汞爲防腐劑，毒素精製法制造的精製類毒素未除遊離甲醛者可免加防腐劑。
3.8 類毒素保存於2～8℃，自脫毒合格之日起不得超過3年。
5.4 精製類毒素檢定和保存
4.1pH應爲6.4～7.4
4.2 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行
4.3 純度
應不低於1500Lf/mgPN。
4.4 安全試驗
用生理鹽水將各亞批等量混合的精製類毒素稀釋成50Lf/ml，用體重300～400g豚鼠4只，每隻腹側皮下注射5ml，觀察30天。前5日注意觀察注射局部，第10、20、30天稱取體重。觀察期間每隻動物體重不得持續下降，到期每隻動物體重應比注射前增加，注射局部無壞死，無連片脫皮、脫毛。後期不得有麻痹症狀。
4.5 效力試驗
將各亞批等量混合的精製類毒素稀釋成35Lf/ml，用體重270～350g健康豚鼠5只，每隻皮下注射0.5ml，第30天各攻擊10MLD白喉毒素。用於配製含有百日咳菌苗的製品，可按成品比例與百日咳菌苗配成小量二聯製劑樣品，免疫方法與劑量同上，第30天各皮下攻擊50MLD白喉毒素。二種攻毒均觀察7日，攻擊後動物死亡數不得超過20%。同時另用體重240～270g健康豚鼠3只，各皮下攻擊1MLD白喉毒素作對照，其中2只應在96小時內死亡，允許1只晚死或發病。
4.6 保存與效期
保存於2～8℃。自精製之日起效期爲3年半。
5.5 吸附劑的配製
見《吸附精製破傷風類毒素製造及檢定規程》中5項。
5.6 吸附精製類毒素的製造
6.2氫氧化鋁用量不得超過3mg/ml。
6.3 吸附製品應加0.005%～0.01%（g/ml）硫柳汞爲防腐劑。
6.4 同批精製類毒素及同批吸附劑吸附的製品爲1批。用大罐吸附者每罐爲1批，所用精製類毒素及吸附劑可多批混合，但各不得超過3批。
5.7 成品檢定
7.1理化性狀
7.1.1 吸附精製白喉類毒素振盪後應爲乳白色均勻懸液，無搖不散的凝塊或異物。
7.1.2pH值應爲6.0～7.0。
7.1.3 氫氧化鋁含量不應超過3mg/ml。
7.1.4 氯化鈉含量爲0.75%～0.9%（g/ml）。
7.1.5硫柳汞含量不應超過0.01%（g/ml）。
7.1.6 遊離甲醛含量不應超過0.02%（g/ml）。
7.2 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
7.3 安全試驗
每亞批取樣等量混合，用體重300～400g健康豚鼠4只，每隻腹側皮下注射2.5ml，觀察30天，注射部位可有浸潤，經5～10天變成硬結，30天可吸收不完全，在第10、20、30天稱體重，到期每隻動物體重比注射前增加，豚鼠無晚期麻痹者評爲合格。
7.4 效力試驗
每亞批取樣等量混合，用體重300～350g健康豚鼠5只，每隻皮下注射0.1ml，第30天各皮下攻擊200MLD白喉毒素，觀察7日，攻毒後動物死亡數不應超過20%。同時另用體重240～270g健康豚鼠3只，各皮下攻擊1MLD白喉毒素作對照，其中2只應在96小時內死亡，允許1只晚死或發病。
7.5 穩定性試驗
生產工藝有改變時應做穩定性試驗。抽三批不同批號的精製類毒素配製的成品，保存於2～8℃，在效期結束之日進行效力檢定，應符合規程要求。
7.6 鑑別試驗
抽取樣品加構櫞酸鈉將吸附劑溶解後作絮狀試驗，或將樣品調pH至9.0作凝膠免疫沉澱試驗，以出現絮狀反應或免疫沉澱反應者爲合格。
5.8 保存與效期
6 WHO推薦的白喉類毒素效價測定方法
可選用以下兩種方法之一種進行。
6.1 Vero細胞測定抗體法
用生理鹽水將吸附白喉類毒素標準品和待檢樣品以2倍稀釋法稀釋成3～5個適當稀釋度，每一稀釋度樣品免疫體重10～14g小白鼠8只，皮下注射0.5ml，免疫5周後，每個小白鼠採血，分離血清，56℃30分鐘滅活，放-20℃保存。
2 毒素試驗量測定
Vero細胞測定白喉抗體試驗時毒素試驗量採用Lcd/10000。
在96孔培養板中用RPMI1640（或199）培養液將毒素做2倍系列稀釋，每孔50μl，然後向各孔中加入50μl標準白喉抗毒素（0.0001IU），用膠帶密封，在室溫放置1小時後，加入50μlVero細胞懸液（見3項）密封，放37℃CO2孵箱培養6～7天后，觀察結果，使細胞死亡的最大毒素稀釋度孔（紅色）就是Lcd/10000。
Lcd/10000的毒素量約相當於1×10-4Lf的毒素適用於本試驗。
3 Vero細胞
RPMI1640（或199）培養液（加青黴素100IU/ml，鏈黴素100μg/ml，胎牛血清10%）。Vero細胞培養於150cm2培養瓶中，待細胞長成佔瓶底80%～100%單層時，棄去上層培養液，加10ml0.25%胰酶，放37℃數分鐘，棄去胰酶，加入10ml培養液，打勻細胞進行計數（1瓶150cm2培養瓶大約可得10～40×106細胞）。用培養液調整細胞濃度至2.5×105細胞/ml。
用吸附白喉類毒素免疫1批小白鼠，免疫5周後採血，分離血清，分裝小管，冷凍乾燥，保存於-20℃。
按下圖將培養板編號：
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
C1
D1
E1
F1
G1
H1
（1）向每孔加入50μl培養液，但A11、A12和H11、H12孔不加，而G11、G12加100μl培養液。
（2）取8份待檢血清，分別加入A1至H1孔各50μl，橫向進行2倍系列稀釋，直至A10和H10孔。
（3）將標準白喉抗毒素稀釋至0.008IU/ml，加入A11、A12、B11和B12孔各50μl，從B11和B12孔開始豎向做2倍稀釋至D11和D12孔。
（5）除G11和G12孔外，向其餘各孔中加入毒素（Ldc/10000）50μl，輕輕轉動培養板，混勻，在培養板上貼上膠帶將板孔封閉，放室溫1小時。
（6）收集Vero細胞，進行計數，並稀釋成2.5×細胞/ml的Vero細胞懸液。
（7）室溫放置1小時之培養板，去膠帶，立即加入50μlVero細胞懸液，再用膠帶封閉培養板，放37℃CO2孵箱培養6天。在24小時及48小時檢查膠帶封閉情況，如出現封閉不嚴應更換。
（8）培養6天后取出培養板，根據培養液顏色變化記錄結果，黃色爲（+），紅色爲（-），羲色不明顯者則可用顯微鏡觀察，如單層細胞完整無損則爲（+），否則記錄（-）。最終結果以打分表示，即變成黃色的最高稀釋度孔的2的指數，例如：變黃的最後一孔是1/256即28，則結果記爲8。
6 試驗要求
E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero細胞敏感度都出現（-），如果出現（+），則毒素量和細胞敏感度都很低，應重試。
細胞孔G11、G12和陽性對照孔H11、H12必須是（+），如出現（-），應重視。
Lcd/10000毒素量的準確性，根據以上計劃下列各孔中所加標準抗毒素爲：
孔A11和A120.0004IU
B11和B120.0002IU
C11和C120.0001IU
D11和D120.00005IU
如毒素用量準確（Lcd/10000），則A11、A12和B11、B12孔應爲（+），而C11、C12和D11、D12應爲（-），否則應重試。
7 結果計算
用平行線分析法進行結果計算
8 結果判定
待檢樣品的效價每劑量應不少30IU。如95%可信限大於50%～200%，則95%可信限的低限效價應大於30IU/1個人用劑量。
6.2 豚鼠毒素攻擊法
1 免疫及攻擊
用生理鹽水將吸附白喉類毒素標準品和待檢樣品稀釋成等比間隔的3～5個稀釋度（中間的稀釋度必須在攻毒後能保護約半數動物），每一稀釋度樣品免疫體重250～300g之豚鼠至少10只，另外5只豚鼠不注射作爲對照。免疫後4周，每隻免疫豚鼠攻擊白喉毒素100LD50，皮下注射1.0ml。對照組健康動物注射100倍稀釋之上述毒素，每隻皮下注射1.0ml。攻擊毒素後觀察5日，每日記錄結果。
2 試驗成立應具備的條件
（1）檢品的最低稀釋度能保護半數以上動物。
（2）檢品的最高稀釋度保護半數以下動物。
（3）對照組動物應部分死亡而不全部死亡。
（4）檢品和標準品的劑量反應曲線在平行性及直線性上沒有太大的偏差。
3 結果計算及結果判定
見Vero細胞法7和8項。
7 吸附精製白喉類毒素使用說明書
本品爲乳白色均勻混懸液，含防腐劑硫柳汞，長時間放置後吸附劑下沉，溶液上層應澄明無色，但經振搖後能均勻分散。
7.1 別名
7.2 接種對象
主要爲6個月～12週歲兒童。
7.3 用法
1.上臂三角肌肌內注射。
2.劑量如下：
7.4 禁忌
患嚴重疾病、發熱或有過敏史者及注射白喉類毒素後發生神經系統反應者應禁用。
7.5 反應
注射本品局部可有紅腫、疼痛、發癢，或有低熱、疲倦、頭痛等，一般不需處理即行消退。
7.6 注意事項
1.使用時應充分搖勻，如出現搖不散之凝塊、異物，安瓿有裂紋，製品曾經凍結，標籤不清及過期失效者均不可使用。
2.注射後局部可能有硬結，1～2個月即可吸收，注射第2針時應換另側部位。
4.發熱，急性傳染病，肝、心、腎病，活動性肺結核，血液病，皮膚病，神經系統疾病（乙型腦炎、腦膜炎、脊髓灰質炎等）後遺症及對某些食物、藥物過敏者禁用。
5.本品需防凍，凍後有凝塊者不能用。
6.皮內接種過結核活菌苗的嬰兒，４周內不得在同一胳臂上接種本製品，以免引起寒性膿腫。
7.7 保存
7.8 規格
注射液：5ml、10ml。