生物製品無菌試驗規程

1 拼音

shēng wù zhì pǐn wú jūn shì yàn guī chéng

2 註解

生物製品不得含有雜菌（有專門規定者除外），滅活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在製造過程中應由製造部門按各製品製造及檢定規程規定進行無菌試驗，分裝後的製品須經質量檢定部門做最後檢定。各種生物製品的無菌試驗除有專門規定者外，均應按照本規程的規定進行。

3 抽樣

1.1原液及半成品

原液及半成品應每瓶分別進行無菌試驗，其抽樣量應至少爲0.1%，但不得少於1.0ml。

1.1.1　大罐稀釋的製品抽樣數量不得少於10ml。

1.1.2　原液及半成品每開瓶一次，應如上法抽驗。

1.2　成品

每亞批均應進行無菌試驗，樣品應隨機抽取，應具有代表性（包括分裝過程的前、中、後樣品）。

1.2.1分裝量在100支（瓶）或以下者抽檢不少於5支，101～500支（瓶）者抽檢不少於10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽檢不少於20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽檢40支（瓶）。

1.2.2每瓶裝量20ml以上的凍幹血液製品，每櫃凍幹200瓶以下者抽檢2瓶，200瓶及以上者抽檢4瓶。6～20ml抽檢量加倍。5ml和5ml以下者按1.2.1項抽檢。

1.3凡規定需作支原體檢查的製品，均應在半成品時按亞批進行檢查，成品可不再做。

4 無菌試驗用培養基（培養基處方可附錄1）

2.1　檢查製品中本菌是否存活應採用適於本菌發育生長的培養基（在半成品時檢查，有專門規定者除外）。

2.2　檢查需氧性和厭氧性雜菌應採用硫乙醇酸鹽培養基。檢查不含汞類防腐劑製品中的需氧性和厭氧性雜菌時，該培養基中可不加硫乙醇酸鹽。

檢查黴菌和腐生菌應採用改良馬丁培養基。

檢查混濁製品可採用不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基。檢查活菌苗時可加大瓊脂含量，做成斜面。

2.3　檢查支原體應採用豬胃消化液半固體或牛心消化液半固體培養基。

2.4　生物製品無菌試驗用培養基亦可用經檢定合格的乾燥培養基配製。

2.5　無菌試驗培養基的靈敏度，乙型溶血性鏈球菌（32210株）應達到10-8，短芽胞桿菌（7316株）和生孢子梭狀芽胞桿菌（64941株）應達到10-7，白色念珠菌（ATCc　10231）和臘葉芽枝黴應達到10^-6。

2.6　生物製品無菌試驗培養基由質量檢定部門與培養基製造部門會同進行靈敏度試驗。每當更換主要原材料時，應進行靈敏度試驗，合格後方可應用（靈敏度試驗法見附錄2、3）。

2.7　各生產單位的質量檢定部門應定期抽檢無菌試驗培養基的靈敏度，檢定所應定期抽檢各所的無菌試驗培養基。

5 無菌試驗方法

3.1　無菌試驗取樣、移種等全部操作，應在無菌操作室內或無菌條件下進行，無菌操作室應經常保持清潔，在每次操作前，應徹底消毒。

3.2　菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類製品及粘稠不易過濾的血液製品應用直接接種法進行無菌試驗。人白蛋白及人丙種球蛋白（包括各種劑型及應用途徑的製品）應用薄膜過濾法進行無菌試驗，其他血液製品亦可用薄膜過濾法或直接接種法進行。

3.3　直接接種法

3.3.1　菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類製品

3.3.1.1　每安瓿裝量5.0ml以上者（不含5.0ml）取樣不應少於1.0ml，裝量在5.0ml以下者（含5.0ml）取樣不得少於0.5ml，裝量不足0.5ml者，全部吸取。

3.3.1.2　含防腐劑的製品，接種量與培養基的比例：用苯酚或氯仿作防腐劑者至少爲1:20，用汞作防腐劑者或製品內含有甲醛、抗生素者至少爲1:50。先按此比例接種於硫乙醇酸鹽培養基內增菌，於20～25℃培育3～4天后移種至硫乙醇酸鹽培養基、適宜的瓊脂斜面、改良馬丁培養基各2管，每管0.5ml。將硫乙醇酸鹽培養基、適宜的瓊脂斜面各1管置30～35℃培育，其餘各管置20～25℃培育，培育時間除有專門規定者外共爲8天。

3.3.1.3　不含防腐劑製品，裝量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合，裝量在5.0ml以上者每7支安瓿混合，將混合後的樣品直接接種一組培養基，分別置20～25℃、30～35℃培育，培育時間共爲8天。

3.3.1.4　支原體培養基臨用時將半固體煮沸10～15分鐘後，冷卻到56℃左右，加入未滅能馬血清或滅能小牛血清和酵母浸液（培養基、血清、酵母浸液之比爲7:2:1），並可酌情加入適量青黴素或醋酸鉈，充分搖勻，等冷至35～37℃時種入待檢樣品0.5～1.0ml，共接種2支培養基，置35～37℃培育14天。

3.3.1.5　混濁和接種後不能判定結果的製品，可取規定量的樣品接種於不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基（200ml）內進行增菌培養，3～4天后移種。培養基種類和支數、培育溫度同3.3.1.2項，共培育8天后判定結果。

3.3.2　血液製品

3.3.2.1　取規定抽樣數，按下列規定，從每瓶抽取樣品，並全部接種完。

樣品每瓶裝量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支裝量爲15ml的培養基，接種1.0ml。

樣品每瓶裝量以下者（不含）抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽樣，每支裝量爲40ml的培養基，接種5.0ml。

應接種的培養基支數依取樣的總量而定。接種硫乙醇酸鹽培養基與改良馬丁培養基支數之比爲2:1。

接種後將硫乙醇酸鹽培養基總支數的1/2置30～35℃培育，其餘置20～25℃培育，改良馬丁培養基置20～25℃培育，培育時間不少於14天。

3.4　薄膜過濾法

濾膜孔徑爲0.22～0.3μm。

取規定抽檢樣品數，每瓶裝量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入滅菌薄膜過濾器內，加壓或減壓過濾。如爲含汞防腐劑者，在樣品過濾後，應用滅菌生理鹽水或其他適宜溶劑沖洗濾膜3次，每次100ml。過濾後，無菌取出濾膜，分別放入硫乙醇酸鹽培養基2支及改良馬丁培養基1支（每支裝量不少於40ml，高度不得低於7cm）。如果使用一個過濾裝置，則將該膜剪成三等分，分別放入規定培養基中。將濾膜放入培養基後，一支硫乙醇酸鹽培養基置30～35℃培育，其餘各支培養基置20～25℃培育。培育時間不少於7天。

最好採用全封閉式一次性微孔過濾集菌器，要求每支培養器培養裝量爲100ml。

3.5　檢查厭氧性雜菌用培養基需加熱驅氧者，必須冷卻到45℃以下再行接種。

3.6　凍乾製品按使用說明書或瓶籤規定的稀釋量稀釋後進行無菌試驗。

6 判定

4.1　無雜菌生長判爲合格（有專門規定者除外）。

4.2　無菌試驗發現雜菌生長，可複試。該製品量應加倍。若複試仍有同樣雜菌生長，該製品判爲不合格。如爲不同雜菌生長，可第二次複試，復試樣品爲第一次複試量的2倍，若仍有雜菌生長該製品判爲不合格。支原體陽性者不復試，該批製品判爲不合格。

4.3　成品無菌試驗不合格的亞批數佔整批的30%以上時，由質量檢定部門會同有關部門根據具體情況，全部或部分廢棄。

7 附錄1 無菌試驗培養基處方

8 附錄2 需-厭氧菌無菌試驗培養基靈敏度試驗法

1　菌種

1.1　需氧菌

乙型溶血性鏈球菌（32210株），短芽胞桿菌（7316株）。

1.2厭氧菌

生孢子梭狀芽胞桿菌（64941株）。

以上菌株均由中國藥品生物製品檢定所分發。

2　培養基

凡應用於無菌試驗的培養基（增菌和試驗用）都應進行靈敏度試驗。

3　操作

3.1　不應在同一無菌操作室內同時操作2個菌株。

3.2　將菌種接種於適宜的培養基，經30～35℃培育一定時間（乙型溶血性鏈球菌和生孢子梭狀芽胞桿菌培育24～48小時，短芽胞桿菌培育18～20小時）後，將乙型溶血性鏈球菌和短芽胞桿菌分別刮入滅菌的生理鹽水內製成均勻菌液，生子孢梭狀芽胞桿菌先將菌液吸入滅菌的試管內，再用滅菌生理鹽水稀釋適宜濃度製成均勻菌液，再將菌液稀釋至與標準比濁管相同之濃度。然後用0.1%蛋白腖水作10倍系列稀釋。

3.3　將10^-6～10^-8（短芽胞桿菌、生子孢梭狀芽胞桿菌爲10^-6～10^-8，乙型溶血性鏈球菌爲10^-7～10^-9）菌液各1ml分別接種到9ml（用於厭氧菌的培養基在試管中裝置高度不得低於7cm）試驗用培養基中，每個稀釋度至少接種3管，並用未接種的培養基做對照，將接種乙型溶血性鏈球菌、生子孢梭狀芽胞桿菌的培養基，置30～35℃培育3天，接種短芽胞桿菌的培養基培育5天，記錄結果。

4　結果判定

以接種後培養基管數的2/3以上呈現生長的最高稀釋度爲該培養基的靈敏度，3次試驗中，以2次達到的最高靈敏度爲判定標準。

9 附錄3 黴菌無菌試驗培養基靈敏度試驗法

1　菌種

白色念珠菌、臘葉芽枝黴，由中國藥品生物製品檢定所分發。

2　培養基

凡應用於黴菌無菌試驗用的培養基都應進行靈敏度試驗。

3　操作

3.1　操作黴菌的無菌室應與其他無菌室隔離，有2個以上菌株試驗時，不應在同一無菌操作室內同時進行。

3.2　將菌接種在土豆培養基上，20～25℃培養5～7天后用滅菌生理鹽水洗下菌苔，移入裝有玻璃珠的大管中將孢子打散，經裝有脫脂棉注射器過濾。將菌液稀釋至與標準比濁管相同之濃度，然後做10倍系列稀釋。

3.3　將10-5～10-7菌液各1ml分別接種到9ml試驗培養基中，每個稀釋度至少接種3管並用未接種過的培養基作對照，20～25℃培育5天，逐日觀察結果。

4　結果判定

以接種培養基管數的2/3以上呈現生長的最高稀釋度爲該培養基的靈敏度，3次試驗中以2次達到的最高靈敏度爲判定標準。