3 卡介菌多糖核酸注射液藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Kajiejun Duotang Hesuan Zhusheye
3.1.3 英文名
BCG Polysaccharide and Nucleic Acid Injection
3.2 定義、組成及用途
本品系用卡介菌經培養後收集菌體，採用熱酚法提取菌體中的多糖與核酸，經純化後以滅菌生理氯化鈉溶液配製而成。不含防腐劑和抗生素。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
卡介菌多糖核酸製造及檢定設施必須與其他生物製品製造室嚴格分開。所需用具如高壓鍋、冰箱及器具等，均須單獨設置並專用。從事卡介菌多糖核酸製造的工作人員及進入卡介菌多糖核酸製造室的人員，必須身體健康，經X線檢查無結核病，且以後每年需接受X線檢查1～2次，可疑者應暫離卡介菌多糖核酸製造室工作，其健康檢查記錄必須保存備查。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 菌種
3.4.1.1 2.1.1 名稱及來源
採用卡介菌CMCC95060（D2PB302）菌株。嚴禁採用通過動物傳代的菌種用於生產。
3.4.1.2 2.1.2 種子批的建立
3.4.1.3 2.1.3 種子批的傳代
3.4.1.4 2.1.4 種子批的檢定
2.1.4.1 鑑別試驗
（1）培養特性
卡介菌在蘇通培養基上生長良好，培養溫度爲37～39℃之間。抗酸染色應爲陽性。在蘇通馬鈴薯培養基上培養的卡介菌應幹皺成團略呈淺黃色。在牛膽汁馬鈴薯培養基上爲淺灰色黏膏狀菌苔。在雞蛋培養基上有突起的皺型和擴散型兩類菌落，且帶淺黃色。在蘇通培養基上卡介菌應浮於表面，爲多皺、微帶黃色的菌膜。
（2）鑑別試驗
採用多重PCR法檢測卡介菌基因組特異的缺失區RD1，應無RD1序列存在，供試品PCR擴增產物應爲196bP核酸片段，並與檢測參考品一致。
2.1.4.2 純菌試驗
按（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）的方法進行，生長物做塗片鏡檢，不得有雜菌。
2.1.4.3 毒力試驗
用結核菌素純蛋白衍生物皮膚試驗（皮內注射0.2ml，含10IU）陰性、體重300～400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每週稱體重，觀察5周動物體重不應減輕；同時解剖檢查，大網膜上可出現膿皰，腸繫膜淋巴結及脾可能腫大，肝及其他臟器應無肉眼可見的病變。
2.1.4.4 無有毒分枝桿菌試驗
用結核菌素純蛋白衍生物皮膚試驗（皮內注射0.2ml，含10IU）陰性、體重300～400g的同性豚鼠6只，於股內側皮下各注射1ml菌液（10mg/ml），注射前稱體重，注射後每週觀察1次注射部位及局部淋巴結的變化，每2周稱體重1次，豚鼠體重不應降低。6周時解剖3只，滿3個月解剖另3只，檢查各臟器應無肉眼可見的結核病變。若有可疑病竈時，應做塗片和組織切片檢查，並採取部分病竈磨碎，加少量生理氯化鈉溶液混勻，由皮下注射2只豚鼠，若證實系結核病變，該菌種即應廢棄。當試驗未滿3個月時，豚鼠死亡則應解剖檢查，若有可疑病竈，即按上述方法進行，若證明系結核病變，該菌種即應廢棄。若證實屬非特異性死亡，且豚鼠死亡1只以上時應複試。
3.4.1.5 2.1.5 種子批的保存
3.4.2 2.2 精製卡介菌多糖核酸
3.4.2.1 2.2.1 生產用培養基
生產用培養基爲蘇通馬鈴薯培養基、膽汁馬鈴薯培養基或液體蘇通培養基。
3.4.2.2 2.2.2 菌種傳代與培養
啓開工作種子批菌種，在蘇通馬鈴薯培養基、膽汁馬鈴薯培養基以及液體蘇通培養基上每傳1次爲1代。在馬鈴薯培養基上培養的菌種放冰箱保存，不得超過2個月。用於生產的培養物的代次不得超過12代。
3.4.2.3 2.2.3 菌體收集
培養物應逐瓶檢查，若有污染、渾濁等情況應廢棄。收集馬鈴薯培養基內培養物或液體蘇通表面培養物，壓幹，加入適量注射用水，以高速粉碎機破碎菌體後備用。
培養物自收穫之日起，其低溫（-20℃以下）保存的時間不得超過2周，且每個提取批混合的菌體不得超過5個培養批。
3.4.2.4 2.2.4 提取
取破碎菌懸液與等量熱酚混勻，靜置或離心沉澱菌體，收集上清液，可採用凝膠層析過濾法、超濾法或其他適宜的方法除酚，所用方法應爲經批准的方法。除酚後的上清液加入適量乙醇沉澱多糖核酸，收集沉澱物。分別以乙醇、乙醚混勻洗滌，離心或抽濾後乾燥即得精製多糖核酸。
3.4.2.5 2.2.5 精製多糖核酸檢定
按3.1項進行。
3.4.2.6 2.2.6 精製多糖核酸保存與有效期
3.4.3 2.3 半成品配製
用生理氯化鈉溶液將精製多糖核酸稀釋至多糖濃度爲0.35mg/ml，核酸應不低於50μg/ml。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分裝與滅菌
應符合“生物製品分裝和凍幹規程”及附錄Ⅰ A 有關規定，封口後於121℃溼熱滅菌20分鐘。
3.4.4.3 2.4.3 規格
每安瓿1ml，含卡介菌多糖0.35mg、核酸不低於40μg。
3.4.4.4 2.4.4 包裝
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 精製多糖核酸檢定
3.5.1.1 3.1.1 乾燥失重
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅶ L），失重應小於10%。
3.5.1.2 3.1.2 多糖含量測定
用生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至0.05mg/ml，採用蒽酮法測定多糖，多糖含量應爲70%～80%。
3.5.1.3 3.1.3 核酸含量測定
用生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至0.05mg/ml，採用分光光度法（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A），於258nm波長下測定核酸，核酸含量應爲10%～20%。
3.5.1.4 3.1.4 蛋白質含量測定
用生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至0.05mg/ml，採用Lowry法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B 第二法），蛋白質含量應小於0.5%。
3.5.1.5 3.1.5 乙醇和乙醚殘留量測定
採用毛細管柱頂空進樣系統程序升溫氣相色譜法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ V），乙醚、乙醇殘留量均應不高於0.5%。
採用固定液爲二甲基聚硅氧烷毛細管柱（30m×0.53mm，塗膜厚0.88μm）；柱溫50℃，維持2分鐘，以適宜的升溫速率升至200℃，維持1分鐘；以氮氣爲載氣；流速爲每分鐘3ml；進樣口溫度220℃；頂空瓶平衡溫度80℃，平衡時間30分鐘；採用火焰離子化檢測器（ FID），溫度爲250℃。理論板數不低於5000，分離度不低於2.0；以內標法測定（採用0.2mg/ml丁酮溶液爲內標溶液），相對標準偏差（RSD）應不大於5%。
3.5.1.6 3.1.6 微生物限度檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ G），不得檢出大腸桿菌和黴菌，雜菌檢出應不高於100個菌/g。
3.5.2 3.2 成品檢定
3.5.2.1 3.2.1 物理檢查
3.2.1.1 外觀應爲無色澄明液體。
3.2.1.2 可見異物
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅴ B），應符合規定。
3.2.1.3 裝量
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ A），應不低於標示量。
3.5.2.2 3.2.2 pH值
應爲6.0～7.2（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.5.2.3 3.2.3 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.2.4 3.2.4 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F），應符合規定。
3.5.2.5 3.2.5 多糖含量測定
採用蒽酮法測定多糖，其含量應爲0.28～0.42mg/ml。
3.5.2.6 3.2.6 核酸含量測定
採用分光光度法（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A）於258nm波長下測定核酸，核酸含量應爲配製量（μg/ml）±20%，並在40～100μg/ml限度範圍之內。
3.5.2.7 3.2.7 熱原檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ D），應符合規定。按家兔體重每1kg注射0.5ml，含多糖應不少於0.1mg。
3.5.2.8 3.2.8 效力測定
用體重20～22g BALB/c小鼠，試驗組和對照組各10只。每隻腹腔注射經預標化的稀釋豬血清0.5ml進行致敏，隔日1次，共三次。未次致敏後次日，試驗組每隻腹腔注射樣品1ml，對照組每隻腹腔注射生理氯化鈉溶液1ml，隔日1次，共7次，末次注射後次日，每隻小鼠靜脈注射致敏濃度10倍量豬血清，對照組與試驗組發病動物數及發病指數應有顯著差異。
1分：匍匐不起，走路搖擺；
2分：癱瘓；
3分：痙攣跳躍或蛙跳、側臥、呼吸深、在31～60分鐘或更長時間後死亡；
4分：30分鐘以內死亡。
過敏值在1分以上者爲發病。
3.5.2.9 3.2.9 鑑別試驗
採用多重PCR法檢測製品中核酸產物，應無RD1序列存在，供試品PCR擴增產物應爲196bP核酸片段，並與參考品一致。
採用ET1（5'-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3'）、ET2（5'-CTGGCTATATTCCTGGGCCCGG-3'）、ET3（5'-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3'）三條引物，分別以滅菌超純水稀釋至終濃度爲10μM。DNA分子量標記物爲50bp DNA ladder。
取凍幹BCG DNA參考品1支，加入滅菌超純水200μl復溶，靜置2～3分鐘待用（參考品溶液復溶後可重新分裝於容器中置-20℃凍存，每次使用1支，避免反覆凍融）。
取供試品5μl，加至45μl反應試劑中[10倍PCR緩衝液（pH 8.3 100mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L KCl,7.5mmol/LMgCl2）5μl、dNTP Mixture 2μl、5U/μl TaKaRa Taq 酶0.3μl、2μl引物ET1、4μl引物ET2、2μl引物ET3，滅菌超純水29.7μl]，共50μl反應體系。取BCG DNA參考品溶液5μl作爲對照，同法操作。每個樣品重複2管。
反應體系於94℃預變性10分鐘，然後94℃變性1分鐘、64℃退火1分鐘、72℃延伸30秒，循環30次後，72℃再延伸7分鐘。取PCR產物10μl加6倍lodding buffer[配方爲①吸取2ml EDTA （500mmol/L pH 8.0）加入約40ml雙蒸水；②再稱量250mg溴酚藍；③量取50ml丙三醇；④定容至100ml，4℃保存]2μl混勻後上樣於3%的瓊脂糖凝膠泳道，50bp DNA ladder直接上樣6μl。於100mA電泳50分鐘。採用凝膠成像儀，以50bp DNA ladder爲分子量標記，觀察供試品與參考品PCR擴增片段分子量大小。供試品擴增片段應爲196bp的核酸片段，與參考品DNA擴增條帶長度一致，判爲合格。
3.5.2.10 3.2.10 乙醇和乙醚殘留含量測定
採用毛細管柱頂空進樣系統程序升溫氣相色譜法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ V），乙醇殘留含量小於0.005%，乙醚殘留含量小於0.0005%。
採用固定液爲二甲基聚硅氧烷毛細管柱（30m×0.53mm，塗膜厚0.88μm）；柱溫爲50℃，維持2分鐘，以適宜的升溫速率升至200℃，維持1分鐘；以氮氣爲載氣；流速爲每分鐘3ml；進樣口溫度220℃；頂空瓶平衡溫度80℃，平衡時間30分鐘；採用火焰離子化檢測器（FID），溫度爲250℃。理論板數不低於5000，分離度不低於2.0；以內標法測定（採用0.2mg/ml丁酮溶液爲內標溶液），相對標準偏差（RSD）應不大於5%。
3.6 4 保存、運輸及有效期
於25℃以下避光乾燥處保存和運輸。自生產之日起，有效期爲24個月。5 使用說明應符合“生物製品包裝規程”規定和批准的內容。
3.7 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版 第二增補本