3 重組人表皮生長因子滴眼液（酵母）藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Diyanye（Jiaomu）
3.1.3 英文名
Recombinant Human Epidermal Growth Factor Eye Drops（Yeast）
3.2 定義、組成及用途
本品系由高效表達人表皮生長因子基因的酵母，經發酵、分離和高度純化後製成。含適宜穩定劑，不含防腐劑和抗生素。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 工程菌菌種
3.4.1.1 2.1.1 名稱及來源
重組人表皮生長因子工程菌株，系由帶有人工合成的人表皮生長因子基因的DNA片段整合到酵母菌染色體基因組中構建而成。
3.4.1.2 2.1.2 種子批的建立
3.4.1.3 2.1.3 菌種檢定
2.1.3.1 劃種BMG1瓊脂平板
2.1.3.2 染色鏡檢
2.1.3.4 人表皮生長因子表達量
在搖牀中培養，應不低於原始菌種的表達量。
2.1.3.5 人表皮生長因子基因穩定性檢查塗BMG1瓊脂平板，挑選至少50個克隆，用PCR檢測人表皮生長因子基因，陽性率應不低於95%。
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 種子液製備
將檢定合格的工作種子批菌種接種於適宜的培養基中培養，供發酵罐接種用。
3.4.2.2 2.2.2 發酵用培養基
3.4.2.3 2.2.3 種子液接種及發酵培養
在滅菌培養基中接種適量種子液。在適宜溫度下進行發酵，應採用經批准的發酵工藝，並確定相應的發酵條件，如溫度、pH值、溶氧、補料、發酵時間等。
3.4.2.4 2.2.4 發酵液處理
3.4.2.5 2.2.5 純化
採用經批准的純化工藝進行純化，使其達到3.1項要求，即爲人表皮生長因子原液。除菌過濾後保存於適宜溫度，並規定其有效期。
3.4.2.6 2.2.6 原液檢定
按3.1項進行。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 配製與除菌
2.3.1.1 稀釋液配製
按經批准的配方配製稀釋液，配製後應立即用於稀釋。
2.3.1.2 稀釋與除菌
將檢定合格的人表皮生長因子原液用2.3.1.1項稀釋液稀釋至所需濃度。除菌過濾後即爲半成品，應立即分裝或保存於2～8℃。
3.4.3.2 2.3.2 半成品檢定
按3.2項進行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分裝
3.4.4.3 2.4.3 規格
應爲經批准的規格。眼內注射溶液、眼內插入劑及供手術、傷口、角膜穿通傷用的眼用製劑，應不含抑菌劑或抗氧劑或不適當的緩沖劑，且應包裝於無菌容器內供一次性使用。 2.4.4 包裝
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 原液檢定
3.5.1.1 3.1.1 生物學活性
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅹ H）。
3.5.1.2 3.1.2 蛋白質含量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B第二法）。
3.5.1.3 3.1.3 比活性
爲生物學活性與蛋白質含量之比，每Img蛋白質應不低於5.0×105IU。
3.5.1.4 3.1.4 純度
3.1.4.1 電泳法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度爲15%，加樣量應不低於10μg（考馬斯亮藍R250染色法）或5μg（銀染法）。經掃描儀掃描，純度應不低於95.0%。
3.1.4.2 高效液相色譜法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B）。色譜柱採用丁基硅膠烷鍵合硅膠爲填充劑；以A相（三氟乙酸－水溶液：取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻）、B相（三氟乙酸－乙腈溶液：取0.5ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻）爲流動相，在室溫條件下，進行梯度洗脫（22%～37%B相）；上樣量應不低於5μg，于波長280nm處檢測。以人表皮生長因子色譜峯計算理論板數，應不低於500；按面積歸一化法計算，人表皮生長因子主峯面積應不低於總面積的95.0%。
3.5.1.5 3.1.5 分子量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度爲15.0%，加樣量應不低於1.0μg，分子質量應爲5.9kD±0.59kD。
3.5.1.6 3.1.6 外源性DNA殘留量
每100μg蛋白質應不高於10ng（2010年版藥典三部附錄Ⅸ B）。
3.5.1.7 3.1.7 宿主菌蛋白質殘留量
應不高於總蛋白質的0.1%（2010年版藥典三部附錄Ⅸ E）。
3.5.1.8 3.1.8 甲醇含量
甲醇含量應不高於0.002%（2010年版藥典三部附錄Ⅲ C）。
3.5.1.9 3.1.9 等電點
主區帶應爲4.0～5.0（2010年版藥典三部附錄Ⅳ D）。
3.5.1.10 3.1.10 紫外光譜掃描
最大吸收峯波長應爲277nm±3nm（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A）。
3.5.1.11 3.1.11 肽圖（至少每半年測定一次）
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅷ E），應與對照品圖形一致。
3.5.1.12 3.1.12 N-末端氨基酸序列（至少每年測定一次）
用氨基酸序列分析儀測定，其N-末端序列應爲：Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu。
3.5.1.13 3.1.13 鑑別試驗
按免疫印跡法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ A）或免疫斑點法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ B）測定，應爲陽性。
3.5.2 3.2 半成品檢定無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅶ A），應符合規定。
3.5.3 3.3 成品檢定
3.5.3.1 3.3.1 鑑別試驗
按免疫印跡法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ A）或免疫斑點法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ B）測定，應爲陽性。
3.5.3.2 3.3.2 物理檢查
3.3.2.1 外觀應爲無色澄清液體。
3.3.2.2 可見異物
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅴ B），應符合規定。
3.3.2.3 裝量
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅴ F），應符合規定。
3.5.3.3 3.3.3 化學檢定
3.3.3.1 pH值
應爲6.9～7.3（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.3.3.2 滲透壓摩爾濃度依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅴ H），應符合批准的要求。
3.5.3.4 3.3.4 生物學活性
應爲標示量的70%～200%（2010年版藥典三部附錄Ⅹ H）。
3.5.3.5 3.3.5 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.6 4 保存、運輸及有效期
於4～25℃避光處保存和運輸。自分裝之日起，按批准的有效期執行。
3.7 5 介紹
3.8 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版 第二增補本