1 拼音
2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅳ
電泳法是指帶電荷的供試品（蛋白質、核苷酸等）在惰性支持介質（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場的作用下，帶電粒子按各自的速度向極性相反的電極方向進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其含量的方法。除另有規定外，各電泳法照下述方法操作。
2 附錄Ⅳ A 醋酸纖維素薄膜電泳法
2.1 試劑
（1）巴比妥緩衝液（pH8.6） 稱取巴比妥2.76g、巴比妥鈉15.45g，加水溶解使成1000ml。
（2）氨基黑染色液 稱取氨基黑10B 0.5g，溶於甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
（3）漂洗液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。
2.2 測定法
取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm膜條，將無光澤面向下，浸入巴比妥緩衝液（pH8.6）中，待完全浸透，取出夾於濾紙中，輕輕吸去多餘的緩衝液後，將膜條無光澤面向上，置含巴比妥緩衝液（pH8.6）的電泳槽架上，通過濾紙橋浸入巴比妥緩衝液（pH8.6）中。於膜條上距負極端2cm處，條狀滴加蛋白質含量約5%的供試品溶液2～3μl，在0.4～0.6mA/cm[總電流量=電流量（mA/cm）×每條膜的寬度（cm）×膜條數]電流條件下電泳；同時取新鮮人血清作對照，電泳時間以白蛋白與丙種球蛋白之阿的電泳展開距離約2cm爲宜。電泳完畢，將膜條取下浸於氨基黑或麗春紅染色液中，2～3分鐘後，用漂洗液浸洗數次，直至脫去底色爲止。將洗淨並完全乾燥的膜條浸於透明液中，待全部浸透後，取出平鋪於潔淨的玻板上，乾燥後即成透明薄膜，可供測定純度和作標本長期保存。將乾燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀採用反射（未透明薄膜）或透射（已透明薄膜）方式在記錄器上自動繪出各蛋白質組分曲線圖，以人血清作對照，按峯面積計算各蛋白質組分的含量（%）。
2.3 【附註】
3 附錄Ⅳ B 瓊脂糖凝膠電泳法
3.1 試劑
（1）巴比妥緩衝液（pH8.6） 稱取巴比妥4.14g、巴比妥鈉23.18g，加水適量，加熱使之溶解，放冷至室溫，再加疊氮鈉0.15g，溶解後，加水稀釋至1500ml。
和巴比妥緩衝液（pH8.6） 50ml，加熱使完全溶脹。
（3）0.5%氨基黑溶液 稱取氨基黑10B 0.5g，溶於甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
（4）脫色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。
（5）溴酚藍指示液 稱取溴酚藍50mg，加水使之溶解，並稀釋至100ml。
3.2 對照品
正常人血清或其他適宜的對照品。
3.3 供試品溶液的製備
用生理氯化鈉溶液將供試品稀釋成蛋白質濃度爲1%～2%的溶液。
3.4 測定法
趁熱將1.5%瓊脂糖溶液傾倒於大小適宜的水平玻板上，其厚度約3mm，靜置，待凝膠凝固成無氣
泡的均勻薄層後，於瓊脂糖凝膠板負極端的1/3處打孔，孔徑2～3mm。置含有巴比妥緩衝液（pH8.6）的電泳槽架上，測定孔加適量供試品溶液和1滴溴酚藍指示液，對照孔加適量對照品及1滴溴酚藍指示液。用3層濾紙搭橋與巴比妥緩衝液（pH8.6）接觸，100V恆壓條件下電泳2小時（指示劑遷移到前沿）。電泳結束後，用0.5%氨基黑溶液染色，再用脫色液脫色至背景無色。
4 附錄Ⅳ C SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法
大多數蛋白質與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）按重量比結合成複合物，使蛋白質分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質分子的淨電荷，消除了不同蛋白質分子的電荷效應，使蛋白質按分子大小分離。
4.1 儀器
恆壓或恆流電源，垂直板或圓盤電泳槽和制膠模具。
4.2 試劑
（1）水（電阻率不低於18.2MΩ·cm）。
（2）A液 1.5molL三羥甲基氨基甲烷－鹽酸緩衝液。稱取三羥甲基氨基甲烷18.15g，加適量水溶解，用鹽酸調pH值至8.8．加水稀釋至100ml。
（3）B液 30%藹烯酰胺－0.8% N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺溶液（避光保存）。
（5）D液 10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺溶液。（6）E液 10%過硫酸銨溶液，臨用前配製。
（7）F液 0.5mol/L三羥甲基氨基甲烷－鹽酸緩衝液。稱取三羥甲基氨基甲烷6.05g加適量水溶解，用鹽酸調pH值至6.8，加水稀釋至100ml。
（8）電極緩衝液 稱取三羥甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸鈉1g，加適量水溶解，用鹽酸調pH值至8.3，加水稀釋至1000ml。
（9）供試品緩衝液 稱取三羥甲基氨基甲烷0.303g、溴酚藍2mg、十二烷基硫酸鈉0.8g，量取鹽酸0.189ml、甘油4ml，加水溶解並稀釋至10ml，此溶液用於非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，如用於還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，則再加β-巰基乙醇2ml。
（10）分子量標準 供試品的分子量應包括在使用的分子量標準範圍之內。
（11）固定液 量取甲醇250ml、冰醋酸60ml，加水稀釋至500ml。
（12）漂洗液 量取乙醇100ml、冰醋酸50ml，加水稀釋至1000ml。
（13）輔染液 稱取重鉻酸鉀10g，量取硝酸2ml加適量水溶解並稀釋至200ml。用前40倍稀釋。
（14）銀染液 稱取硝酸銀2.04g．加水溶解並稀釋至1000ml。
（15）顯色液 稱取碳酸鈉30g，加適量水溶解，加甲醛0.5ml並稀釋至1000ml。
（16）終止液 量取冰醋酸10ml，加水稀釋至1000ml。（17）考馬斯亮藍染色液 稱取考馬斯亮藍R250 1g，加入甲醇200ml、冰醋酸50ml、水250ml，混勻。
（18）考馬斯亮藍脫色液 量取甲醇400ml、冰醋酸100ml與水500ml，混勻。
4.3 供試品溶液的製備
將供試品與供試品緩衝液按3：1的比例混勻，100℃水浴加熱3～5分鐘。
4.4 測定法
（1）製備分離膠溶液 按下表製成分離膠溶液，灌入模具內至一定高度，加水封頂，室溫下聚合（室溫不同，聚合時間不同）。
凝膠種類 | 濃縮膠 | |||||||
凝膠濃度 | 5% | 7. 5% | 10% | 12.5% | 15% | 17.5% | 4.5% | |
A液 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
B液 | 2.7 | 4 | 5.4 | 6.7 | 8 | 9.4 | 1.35 | |
C液 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 0.9 | |
試液/ml | D液 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.07 |
E液 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.07 | |
F液 | 2.25 | |||||||
H2O | 7.3 | 6 | 4.88 | 3.3 | 2.28 | 0.88 | 4.33 | |
（2）制各濃縮膠溶液 待分離膠溶液聚合後，用濾紙吸去上面的水層，再灌入濃縮膠溶液（配方見上表），插入樣品梳，注意避免氣泡出現。
（3）加樣 待濃縮膠溶液聚合後小心拔出樣品梳，將電極緩衝液注滿電泳槽前後槽，在供試品孔中加入供試品溶液5μg（銀染法）或10μg以上（考馬斯亮藍染色法）。
（4）電泳 接通電源、冷凝水，以恆流10mA條件下開始電泳，至供試品溶液進入分離膠後將電流調至20mA，直至電泳結束。
（5）固定與染色
①銀染法 除另有規定外，銀染法一般不用於定量試驗；做定性試驗時，上樣量可以適當增加。將電泳後的凝膠浸入固定液中過夜，取出，用漂洗液漂洗3次（溫度應不低於25℃），每次10分鐘；漂洗後的凝膠浸於輔染液中7～10分鐘後取出，用水浸洗3次，每次2分鐘；將浸洗後的凝膠浸於銀染液中，置較強日光或類似光源下照射30分鐘，再於室內光線下放置20分鐘；將凝膠自銀染液中取出，用水浸洗2次，每次1分鐘；然後將凝膠浸於顯色液中，每隔2分鐘換液1次，直至蛋白質條帶顯色完全；將凝膠浸於終止液中10分鐘後，取出凝膠保存於水中。
②考馬斯亮藍法 將電泳後的凝膠浸入染色液中過夜取出，浸入脫色液中，直至凝膠底色幾乎無色，取出凝膠保存在水中。
4.5 結果計算
非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠經掃描進行純度分析；還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠中分子量標準，經掃描獲得分子量標準曲線，計算供試品的分子量。
5 附錄Ⅳ D 等電聚焦電泳法
兩性電解質在電泳場中形成一個pH梯度，由於蛋白質爲兩性化合物，其所帶的電荷與介質的pH值有關，帶電的蛋白質在電泳中向極性相反的方向遷移，當到達其等電點（此處的pH值使相應的蛋白質不再帶電）時，電流達到最小，不再移動。本法用於檢測蛋白質類供試品的等電點。
5.1 第一法 等電聚焦垂直板電泳
5.1.1 試劑
（1）水（電阻率不低於18.2MΩ·cm）。
（2）A液 稱取丙烯酰胺29.1g、亞甲基雙丙烯酰胺0.9g，加適量水溶解，並稀釋至100ml，雙層濾紙濾過，避光保存。
（4）供試品緩衝液（4倍濃度） 量取甘油8ml、40%兩性電解質（pH3～10）溶液4ml，加水至20ml。加0.1%甲基紅溶液20μl。
（5）固定液 稱取三氯乙酸34.5g、磺基水楊酸10.4g，加水溶解並稀釋至300ml。
（6）脫色液（平衡液） 量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀釋至2000ml。
（7）染色液 稱取考馬斯亮藍G250（或R250）0.35g，加脫色液300ml，在60～70℃水浴中加熱，使溶解。
（9）正極液（0.01mol/L磷酸溶液） 量取磷酸1ml，加水至1800ml。
（10）負極液（0.01mol/L氫氧化鈉溶液） 稱取氫氧化鈉0.4g，加水溶解並稀釋至1000ml。
5.1.2 供試品溶液的製備
供試品對水透析（或用其他方法）脫鹽後，與供試品緩衝液按3:1（體積比）混勻（供試品溶液最終濃度應在每1ml含0.5mg以上，如供試品濃度太低，則需要採用適當方法濃縮）。
5.1.3 測定法
裝好垂直平板電泳槽，壓水，於玻璃板和玻璃紙之間加入60%甘油1ml。取水12ml、甘油2ml、A液4.0ml、兩性電解質（pH3～10）溶液（或其他兩性電解質）1.0ml，混勻，脫氣，再加B液72μl，N,N,N',N'-四甲基乙二胺3μl，混勻後注入槽內聚合1小時。每孔加供試品緩衝液20μl，接通冷卻循環水，於10℃、250V（約10mA）條件下電泳30分鐘。每孔加樣20μl，於10℃、500v（約10mA），上限電壓2000V條件下，電泳約3.5小時，同時做等電點標準。電泳結束後，即將凝膠放入固定液中固定20分鐘以上；取出，放入平衡液中20～30分鐘；再放入染色液中40～60分鐘，然後用脫色液浸洗至背景無色，取出放入保存液中30分鐘；亦可做成幹膠保存。以標準品的等電點（pI）對其相應的遷移距離作直線迴歸，將供試品的遷移距離代入直線迴歸方程，求出供試品的等電點。
5.2 第二法 等電聚焦水平板電泳
5.2.1 試劑
（1）水（電阻率應不低於18MΩ·cm）。
（2）A液 稱取丙烯酰胺29.1g、亞甲基雙丙烯酰胺0.9g，加適量水溶解，並稀釋至100ml，雙層濾紙濾過，避光保存。
（4）固定液 稱取三氯乙酸34.5g、磺基水楊酸10.4g，加水溶解並稀釋至300ml。
（5）脫色液（平衡液） 量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml．加水稀釋至2000ml。
（6）染色液 稱取考馬斯亮藍G250（或R250）0.35g，加脫色液300ml，在60～70℃水浴中加熱，使溶解。
（8）正極液（0.5mol/L磷酸溶液） 量取磷酸50ml．加水至1800ml。
（9）負極液（0.2mol/L氫氧化鈉溶液） 稱取氫氧化鈉8g，加水溶解並稀釋至1000ml。
5.2.2 供試品溶液的製備
將供試品對水透析（或用其他方法）脫鹽，並使蛋白質含量調節至每1ml含0.5mg以上（如供試品蛋白質濃度太低，則需採用適當方法濃縮）。
5.2.3 測定法
量取A液6.25ml、pH 3～10兩性電解質（或其他兩性電解質）1.5ml、水17.1ml，抽氣5～10分鐘，加B液175μl、N,N,N',N'-四甲基乙二胺20μl，混勻後緩慢地注入水平模具內，室溫下聚合。將已聚合的聚丙烯酰胺凝膠放在冷卻板上，其間塗以液體石蠟或煤油並避免產生氣泡。用正極液與負極液分別潤溼正極與負極電極條，然後分別放於陽極與陰極上，將加樣濾紙放在凝膠上。加供試品溶液5～30μl。將電極對準電極條的中心，加蓋，在上限電壓2000V、上限電流50mA、功率爲每1cm膠1W、溫度4℃的電泳條件下，開始電泳，電泳2.5小時；同時做等電點標準。電泳30分鐘後去掉加樣濾紙，電泳結束後，即將凝膠放入固定液中固定20分鐘以上；取出放入平衡液20～30分鐘，再放入染色液40～60分鐘，然後用脫色液浸洗至背景無色，取出放入保存液中30分鐘，晾乾；亦可做成幹膠永久保存。以標準品的等電點（pI）對其相應的遷移距離作直線迴歸，將供試品的遷移距離代入直線迴歸方程，求出供試品的等電點。