3 概述
膽紅素是血紅蛋白、肌紅蛋白等含鐵卟啉化合物在體內的代謝產物，其來源有三條途徑：①80%～90%來自衰老死亡的紅細胞；②15%～20%來自骨髓合成血紅蛋白過程中的副產品；③其餘來自肌紅蛋白及其他非血紅蛋白正鐵血紅素。血清中膽紅素有兩類，即未結合膽紅素（又稱遊離膽紅素或間接膽紅素）和結合膽紅素（又稱直接膽紅素），在肝臟作用下，膽紅素與葡萄糖醛酸結合成水溶性的膽紅素單葡萄糖苷酸和膽紅素二葡萄糖苷酸。當肝細胞損傷、膽管阻塞、紅細胞破壞增加或壽命縮短時，膽紅素代謝常發生異常，臨牀上即出現黃疸。膽紅素代謝檢查主要用於瞭解有無黃疸、程度，並鑑定其類型。
5 紅細胞血清總膽紅素的醫學檢查
5.1 檢查名稱
5.2 分類
5.3 化驗取材
5.4 紅細胞血清總膽紅素的測定原理
（1）改良咖啡因（J-G）法：血清中結合膽紅素可直接與重氮試劑反應，產生偶氮膽紅素；在同樣條件下，遊離膽紅素需有加速劑使膽紅素氫鍵破壞後與重氮試劑反應。咖啡因、苯甲酸鈉爲加速劑，醋酸鈉維持pH同時兼有加速作用。抗壞血酸（或疊氮鈉）破壞剩餘重氮反應，終止結合膽紅素測定管的偶氮反應，防止遊離膽紅素的緩慢反應。加入鹼性酒石酸鈉使最大吸光度由530nm轉移到598nm，非膽紅素的黃色色素及其他紅與棕色色素產生的吸光度降至可略而不計，使靈敏度和特異性增加。最後形成的綠色是由藍色的鹼性偶氮膽紅素和咖啡因與對氨基苯磺酸之間形成的黃色色素混合而成。
（2）膽紅素氧化酶法：膽紅素氧化酶（BOD）催化膽紅素氧化，生成膽綠素，後者進一步氧化生成淡紫色化合物，在450nm波長比色，吸光度的下降值（△A）與血清膽紅素濃度呈正比。
5.5 試劑
（1）改良咖啡因（J-G）法：
①咖啡因-苯甲酸鈉試劑：稱取無水醋酸鈉41.0g（或CH3COONa·3H2O 63.0g），苯甲酸鈉38.0g，乙二胺四乙酸二鈉（EDT-ANa2）0.5g，溶於約500ml蒸餾水中，再加入咖啡因25.0g，攪拌使溶解（加入咖啡因後不能加熱溶解），用蒸餾水補足至1000ml，混勻。用濾紙過濾，置棕色瓶，室溫保存。
②鹼性酒石酸鈉溶液：稱取氫氧化鈉75.0g，酒石酸鈉（Na2C4H4O6·H2O）263.0g，用蒸餾水溶解並補足至1000ml，混勻。置塑料瓶中，室溫保存。
③5.0g/L亞硝酸鈉溶液：稱取亞硝酸鈉（NaNO2）5.0g，用蒸餾水溶解並稀釋到100ml，混勻，置棕色瓶中，冰箱保存，穩定不少於3個月。作10倍稀釋成0.5g/L，貯冰箱穩定不少於2周。
④5.0g/L對氨基笨磺酸溶液：稱取對氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g/L，溶於800ml蒸餾水中，加入濃鹽酸15ml，用蒸餾水補足至1000ml。
⑤重氮試劑：臨用前取5.0g/L亞硝酸鈉溶液0.5ml和5.0g/L對氨基苯磺酸溶液20ml混合。
⑥5.0g/L疊氮鈉溶液：稱取疊氮鈉0.5g，以蒸餾水溶解並稀釋至100ml。
⑦膽紅素標準液
A.一般用遊離（非結合）膽紅素配製標準液，因此配製標準液的稀釋劑需含白蛋白。可用牛血清白蛋白（40g/L）或人血清代替人血清白蛋白。後者方法如下：收集無溶血、無黃疸、無脂濁的新鮮血清，混合，必要時可用濾菌器過濾。取過濾後的血清1ml，加入24ml新鮮生理鹽水，混合。在414nm波長，1cm光徑，以生理鹽水調零點，其吸光度應小於0.100；在460nm的吸光度應小於0.04。
B.配製標準液的膽紅素須符合下列標準：純膽紅素的氯仿溶液，在25℃條件下，光徑10±0.01mm，波長453mm，摩爾吸光係數應在60700±1600範圍內；改良J-G法偶氮膽紅素的摩爾吸光係數應在74380±866。
C.膽紅素貯存標準液，171μmol/L（10mg/dl）：準確稱取符合要求的膽紅素10mg，加入1ml二甲亞碸，用玻璃棒攪拌，使成混懸液。加入0.05mol/L碳酸鈉溶液2ml，使膽紅素完全溶解，移入100ml容量瓶中，以稀釋用血清洗滌數次併入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml，邊加邊搖（勿用力，以免產生氣泡）。最後以稀釋用血清補足至100ml。配製過程中應儘量避光，貯存容器用黑紙包裹。置4℃冰箱3天內有效，但要求配後儘快作標準曲線。
（2）膽紅素氧化酶法：
①0.1mol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.2：稱取Tris 1.211g，膽酸鈉172.3mg，SDS432.6mg，溶於90ml蒸餾水中，在室溫（25～30℃）用1mol/L鹽酸調節pH至8.2（約用6ml），再加蒸餾水至100ml，置冰箱保存。此液含4mmol/L膽酸鈉、150mmol/L SDS。
②BOD溶液：如系凍幹品，按介紹要求復溶，但復溶後冰箱保存不宜過長（約可保存1周）。如系液體（可能含有甘油），置冰箱或冰室可保存較長時間，BOD貯存液的酶活性一般在數千至1～2萬U/L，BOD工作液的酶活性可按反應液中BOD終濃度達0.3～1.0U/ml計算。
③膽紅素標準液：342μmol/L：按膽紅素測定J-G法配製，或市售合乎要求的標準液。
5.6 操作方法
（1）改良咖啡因（J-G）法：按表1操作。
充分混勻後，波長600nm，對照管調零，讀取各管吸光度；或用蒸餾水調零，讀取測定管及對照管吸光度，用測定管吸光度與對照管吸光度之差（AU-AC），在標準曲線上查出相應的膽紅素濃度。
（2）膽紅素氧化酶法：按表2進行操作。
加入BOD溶液後立即混勻，置37℃水浴5min，用分光光度計，在450或460nm波長，蒸餾水調零，讀各管吸光度。用於對照管的比色杯與非對照管的比色杯不得混用。
5.7 正常值
血清總膽紅素：2～20μmol/L（0.1～1.2mg/dl）。
膽紅素氧化酶法、改良J-G法（重氮法） 臍帶：早產兒：＜34μmol/L （＜2.0mg/dl） 足月兒：＜34μmol/L （＜2.0mg/dl） 0～1天：早產兒：＜137μmol/L （＜8.0mg/dl） 足月兒：＜103μmol/L （＜6.0mg/dl） 3～5天：早產兒：＜274μmol/L （＜16.0mg/dl） 足月兒：＜205μmol/L （＜12.0mg/dl） 其後：早產兒：＜34μmol/L （＜2.0mg/dl） 足月兒：3.4～17.1μmol/L （0.2～1.0mg/dl） 成人：1.7～17.1μmol/L （0.1～1.0mg/dl）
5.8 化驗結果臨牀意義
（1）判斷有無黃疸及其程度：STB17.1～34.2μmol/L爲隱性黃疸；34.2～171μmol/L爲輕度黃疸；171～342μmol/L爲中度黃疸；＞342μmol/L爲重度黃疸。
（2）判斷黃疸的性質：完全阻塞性黃疸爲342～513μmol/L，不完全阻塞爲171～266.8μmol/L，肝細胞性黃疸爲17.1～119.7μmol/L，溶血性黃疸爲＜85.5μmol/L。
（3）膽紅素分類鑑別黃疸類型：總膽紅素和非結合膽紅素增高，見於溶血性黃疸、血型不合的輸血反應、惡性瘧疾及新生兒黃疸等，以非結合膽紅素增高爲主；總膽紅素和結合膽紅素增高爲阻塞性黃疸，如膽石症、肝癌、胰頭癌等，以結合膽紅素增高爲主；總膽紅素、結合膽紅素、非結合膽紅素均增高爲肝細胞性黃疸，如急性黃疸性肝炎、慢性活動性肝炎、肝硬化和急性黃色肝壞死等。
（4）用於肝細胞損害程度和預後判斷：在肝臟疾病中，膽紅素濃度明顯升高，常反映肝細胞損傷嚴重，預後不良。但少數亞急性肝炎可無黃疸出現。膽汁淤積性肝炎，血清膽紅素甚高，而肝細胞受損程度較輕。
（5）有助於瞭解新生兒溶血癥的嚴重程度，制定合理的治療方案。
5.9 附註
（1）改良咖啡因（J-G）法：
①本法測定血清總膽紅素，在10～37℃條件下不受溫度變化的影響。呈色在2h內非常穩定。
②本法靈敏度高（摩爾吸光係數爲74380±866 L·mol－1·cm－1）。
③輕度溶血對本法無影響，但嚴重溶血時可使測定結果偏低。其原因是血紅蛋白與重氮試劑反應形成的產物可破壞偶氮膽紅素，還可被亞硝酸氧化爲高鐵血紅蛋白而干擾吸光度測定。
④疊氮鈉能破壞重氮試劑，終止偶氮反應。凡用疊氮鈉作防腐劑的質控血清，可引起偶氮反應不完全，甚至不呈色。
⑥脂血及色素對測定有干擾，應儘量取空腹血。
⑦標本對照管的吸光度一般很接近，若遇標本量很少時可不作標本對照管，參照其他標本對照管的吸光度。
⑧膽紅素大於171μmol/L的標本可減少標本用量，或用生理鹽水稀釋血清後重做。
⑨結合膽紅素測定，至今無候選參考方法，國內也無推薦方法。方法不同，反應時間不同，結果相差很大。時間短，非結合膽紅素參與反應少，結合膽紅素反應也不完全；時間長，結合膽紅素反應較完全，但一部分非結合膽紅素也參與反應。這是一個很難權衡的問題，在沒有結合膽紅素標準液的情況下，問題更復雜。
Doumas參照Michaelsson及Gambino的方法，在血清中先加入50mmol/L鹽酸，再加入重氮試劑，反應10min，即防止非結合膽紅素反應，又使結合膽紅素反應較完全。
Doumas採用的方法：50mmol/L鹽酸0.8ml，血清0.2ml，混勻。再加重氮試劑0.4ml，混勻，室溫置10min，加入32g/L抗壞血酸0.1ml（或20g/L NaN20.1ml），混勻。最後依次加入鹼性酒石酸鈉溶液1.2ml及咖啡因試劑1.6ml。用非結合膽紅素作標準液時，標準管操作順序同J-G法總膽紅素測定，但在重氮試劑反應後要加入抗壞血酸，最後也要加50mmnl/L鹽酸。
（2）膽紅素氧化酶法：
①BOD濃度可根據所用製品在測定高膽紅素血清標本或342μmol/L標準的反應速度，即能否在5min反應完全而確定，文獻報道BOD在反應液中終濃度爲0.18～1.14U/ml。
②在反應體系中存在足夠活力的BOD前提下，反應時間均爲5min（37℃），也即反應5min時△A達最大值。建議根據所用的試劑盒用高濃度的血清標本或342μmol/L標準液進行反應時間試驗確定之。
③溶血標本可使測定結果偏低，其程度與Hb含量及膽紅素有關，Hb＜1.0g/L，影響不大，Hb＞1.5g/L時，膽紅素測定結果明顯偏低。
④本法在pH 7.3～9.0之間酶活力的pH曲線變化幅度不大，但最適pH爲8.0～8.2。
⑤本法操作簡單、特異性高，線性範圍大，至少在513μmol/L以下呈線性。