3 傷寒、副傷寒甲、乙三聯菌苗製造及檢定規程
[1]本品系用傷寒、副傷寒甲、乙菌分別培育,取菌苔製成懸液經甲醛殺菌,以磷酸鹽緩衝生理鹽水稀釋成每ml含傷寒菌1.5億、副傷寒甲、乙菌各0.75億製成。用於預防傷寒及副傷寒甲、乙。
3.1 菌種
1.1菌種來源
製造傷寒、副傷寒甲、乙三聯菌苗用的菌種及檢定菌種用的各種診斷血清,應由中國藥品生物製品檢定所分發或經同意。
1.2 菌種檢定
檢定菌種可用pH7.2~7.4的肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜的培養基。
1.2.1 培養特性
用37℃培育18~20小時的培養物以磷酸鹽緩衝生理鹽水稀釋成含菌6億/ml,與相應的傷寒、副傷寒甲、乙菌診斷血清做定量凝集試驗,搖勻後放37℃過夜,以肉眼可見到凝集(+)之血清最高稀釋度爲凝集反應之效價,凝集價不應低於血清原效價之半。傷寒菌種加用傷寒Vi及O血清做凝集試驗,應與Vi血清有凝集,與O血清不凝集,或僅有較低凝集。
1.2.3 毒力試驗
用37℃培育12~16小時的瓊脂培養物以生理鹽水稀釋爲下列濃度的菌液:
傷寒、副傷寒乙菌種:3億/ml、1.5億/ml及0.75/ml。
副傷寒甲菌種;15億/ml、7.5億/ml及3.75億/ml。
每一稀釋度的菌懸液腹腔注射體重14~16g之小白鼠,至少5只,每隻0.5ml,觀察3天,使小白鼠於感染後3天內全部死亡的最小劑量爲1個致死量(LD),傷寒、副傷寒乙菌種1LD應不超過1.5億菌,副傷寒甲不超過7.5億菌。
1.2.4 毒性試驗
用37℃培育18~20小時之瓊脂培養物混懸於磷酸鹽緩衝生理鹽水內,傷寒及副傷寒甲菌液加溫56℃1小時,副傷寒乙菌液加溫58℃1小時殺菌(或其他方法殺菌),不加防腐劑。殺菌試驗合格後稀釋爲每ml含菌60、30及15億等3個濃度,每一濃度的菌懸液以0.5ml腹腔注射體重15~18g小白鼠5只,觀察3天,注射7.5億菌之小白鼠應全部生存,注射15億菌之5只小白鼠可有3只死亡。
1.2.5 免疫力試驗
用加溫殺菌(或用其他方法殺菌)不加防腐劑的菌液稀釋成如下的濃度:
副傷寒甲菌液:5億/ml。
每一菌液免疫體重14~16g小白鼠至少30只,每隻皮下注射上述濃度的菌液0.5ml。注射2次,間隔7天,末次免疫後9~11天進行毒菌攻擊。每種死菌菌液免疫之小白鼠各腹腔注射1LD的相應毒菌(含於0.5ml中),同時應用同批飼養或體重與免疫組相同的小白鼠3組,每組至少5只作對照,分別於腹腔注射2、1及1/2LD的毒菌(各含於0.5ml中),觀察3天。對照組小白鼠感染2及1LD者應全部死亡,感染1/2LD者要有部分死亡。傷寒、副傷寒乙菌液免疫組至少保護70%小白鼠活存,副傷寒甲菌液免疫組至少保護60%小白鼠活存,則免疫力試驗爲合格。
免疫力試驗也可用LD50法判定結果:
用加溫殺菌(或用其他方法殺菌)不加防腐劑的菌液稀釋成如下的濃度:
副傷寒甲菌液:5億/ml。
每一菌液免疫體重14~16g之小白鼠至少30只,每隻皮下注射上述濃度的菌液0.5ml,注射2次,間隔7天,末次免疫後9~11天,用培養12~16小時的傷寒、副傷寒甲或乙菌株之菌苔以pH7.2~7.4的肉湯及生理鹽水等稀釋至適當的濃度進行攻擊。免疫組小白鼠應感染100個LD50以上的毒菌。同時應用同批飼養或體重與免疫組相同的小白鼠分爲3~4組,每組至少5只,分別感染不同劑量毒菌作對照。免疫組及地照組分別腹腔注射0.5ml,觀察3天,計算LD50。免疫組至少應保護70%小白鼠存活。
1.2.6 抗原性試驗
選體重2kg左右之健康家兔至少3只,用免疫力試驗所用之菌液靜脈注射3次每次0.5ml,第1次注射7億菌,第2次14億菌,第3次21億菌,每次間隔7天。末次注射後10~14天採血做定量凝集試驗測定效價。傷寒菌免疫的血清對免疫菌效價應不低於1∶12800,副傷寒甲、乙效價不低於1∶6400,2/3家兔血清之凝集價達上述要求即爲合格。
菌種凍幹後應抽取樣品按1.2項進行檢查,合格後可使用3年。以後每次生產前必須檢查全部特性一次,合格者可繼續使用2年。
3.2 菌苗製造
製造傷寒、副傷寒甲、乙三聯菌苗所用的每一菌種選用2個菌株。
2.1 菌種
凍幹菌種啓開後應檢查菌形、純度及進行玻片凝集試驗(傷寒菌加用Vi血清),合格後即可使用。每啓開1支凍幹菌種用於生產不應超過6代。
用pH7.2~7.4的馬丁瓊脂或肉湯瓊脂或其他適宜的培養基。
2.3.1 接種
採用塗種,接種後置37℃培育18~14小時。
2.3.2 採集
採集前逐瓶檢查,有雜菌者廢棄。刮取菌苔混懸於磷酸鹽緩衝生理鹽水中。
2.3.3 純菌試驗
原液採集後應逐瓶取樣接種瓊脂斜面1管,於37℃培育3天,24~26℃1天,有雜菌生長應廢棄。
2.3.4 殺菌
加殺菌劑後的原液應放在37℃,不得超過7天,以後保存於2~8℃。
2.3.5無菌試驗
純菌試驗合格的原液,應取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基及普通瓊脂斜面各1管,放37℃培育5天有本菌生長,可加倍量複試一次;有雜菌生長應廢棄。
2.3.6 原液合併
無菌試驗合格之原液,按不同菌株或不同製造日期分別過濾合併,合併後應加不超過0.5%(g /ml)的苯酚或其他適宜之防腐劑,保存於2~8℃。
2.4 原液檢定
2.4.1 鏡檢
菌形應正常,無雜菌。
2.4.2 凝集試驗
原液與相應血清進行凝集試驗,其凝集效價不應低於血清原效價之半。
2.4.3無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
2.4.4 濃度測定
應按中國細菌濁度標準與質量檢定部門會同測定濃度。
2.4.5 免疫力試驗
原液於無菌試驗合格後與質量檢定部門會同進行。抽驗批數應不少於生產批數的1/5。方法同1.2.5項,唯所用小白鼠每組至少15只。對傷寒或副傷寒甲乙毒菌之攻擊,均應保護60%小白鼠活存爲合格。
原液應保存於2~8℃。原液自採集之日起至用於菌苗稀釋時不得少於4個月,保存效期自採集之日起爲2年半。
2.6 菌苗稀釋
2.6.1 原液配合
稀釋前應先將不同菌種所制之原液按比例配合。每一種菌所加的菌數與應加菌數在總菌數不變的原則下,允許兩種菌之間在20%的範圍內互有增減;同一種菌不同菌株之原液按等量混合,但每個菌株所加的菌數與應加菌數在總菌數不變的原則下,允許兩個菌株之間在40%範圍內互有增減。
2.6.2 菌苗稀釋
稀釋菌苗用含0.25%~0.5%(g /ml)苯酚或其他適宜的防腐劑之磷酸鹽緩衝生理鹽水。
2.6.3 苗菌濃度
菌苗每ml含傷寒菌1.5億,副傷寒甲及副傷寒乙菌各0.75億。
2.7 菌苗分批
同組配合的原液用同批稀釋液在同一日稀釋的種瓶菌苗爲1批。大罐稀釋時應按大罐分批,並按分裝機分爲亞批。
2.8 檢定
稀釋後每批應逐瓶抽樣進行無菌試驗及測定防腐劑含量(大罐稀釋時除外)。
2.9 分裝
3.3 成品檢定
菌苗應爲乳白色懸液,pH值爲6.8~7.4,不應有搖不散的菌塊或異物。苯酚含量應爲0.25%~0.5%(g /ml)。
3.2 菌形及純度
染色鏡檢,應爲革蘭氏陰性桿菌。至少觀察10個視野,平均每個視野內不得有10個以上非典型菌(線狀、粗大或染色可疑桿菌),並不應有雜菌。
3.3 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
3.4 安全試驗
3.4.1 毒性試驗
用體重18~20g之健康小白鼠5只,每隻腹腔注射菌苗0.5ml,或用體重350~450g之健康豚鼠2只,腹腔注射菌苗1.5ml,觀察7日,應無死亡。
3.4.2 防腐劑試驗
用體重18~20g之健康小白鼠2只,每隻皮下注射菌苗0.5ml,用苯酚作防腐劑的菌苗注射的小白鼠可發生戰慄症狀,但不應超過半小時,觀察7日不得有局部膿腫或死亡。
3.4 保存與效期
應保存於2~8℃。自稀釋之日起效期爲1年半。如原液保存超過1年稀釋,應相應縮短效期(自原液採集之日起總效期不得超過2年半)。
4 傷寒、副傷寒甲、乙三聯菌苗使用說明書
本品系用傷寒、副傷寒甲、乙菌分別培育,取菌苔製成懸液經甲醛殺菌,以磷酸鹽緩衝生理鹽水稀釋製成。用於預防傷寒、副傷寒甲、乙。
本品爲乳白色的混懸液,含苯酚防腐劑,不應含有異物或搖不散的凝塊。
4.1 接種對象
重點使用於部位、港口、鐵路沿線工地的工作人員,下水道、糞便、垃圾處理人員,飲食行業、醫務防疫人員及水上居民,或有本病流行地區的人羣。
4.2 用法
2.初次注射本菌苗者,需注射3次,每次間隔7~10天。注射劑量如下:
1~6週歲:第1針0.2ml,第2針0.3ml,第3針0.3ml。
6週歲以上~14週歲:第1針0.3ml,第2針0.5ml,第3針0.5ml。
14週歲以上:第1針0.5ml,第2針1.0ml,第3針1.0ml。
加強注射劑量與第3針相同。
4.3 禁忌
4.4 注意事項
1.用前搖勻。安瓿有裂紋,有異物、搖不散的凝塊或曾經凍結者都不能使用。
2.應備有1∶1000腎上腺素,以供偶有發生休克時急救之用。
4.5 保存
保存於2~8℃暗處。
5 參考資料
- ^ [1] ."《中國生物製品規程》".