3 概述
纖維蛋白肽A(fibrinopepide-A,FPA)是在凝血酶作用下,纖維蛋白原α(A)鏈的精-16和甘-17之間的肽鏈裂解,釋放出由1~16個氨基酸組成的纖維蛋白肽A。是反映體內凝血活性及纖維蛋白最終形成血栓的可靠指標。
5 纖維蛋白肽A的醫學檢查
5.1 檢查名稱
5.2 分類
5.3 取材
5.4 纖維蛋白肽A的測定原理
純化的人FPA包被於固相,液相中的待測FPA競爭抑制抗人FPA與固相FPA的結合,再以酶標記的二抗檢測結合於固相的抗人FPA的量,從標準曲線計算標本中FPA的含量。
5.5 試劑
(1)純人纖維蛋白肽A(FPA)。
(2)兔抗人FPA血清。
(4)皁土(bentonite)、鄰苯二胺(OPD)、肝素、BSA等。
(5)抑肽酶(aprotinin)。
(6)包被緩衝液:0.05mol/L Na2CO3/NaHCO3緩衝液(pH9.5):配法是1.59g Na2CO3,2.93gNAHCO3與0.2gNaN3,溶於1000ml蒸餾水中,4℃保存1周內使用。
(7)洗板液:(PBSVTween20,pH7.4)8.0g NaCl,0.2g KH2PO4,2.98g Na2HPO4·12H2O,0.5mlTween20,0.2g NaN3溶於1000ml蒸餾水中。
(8)標本稀釋緩衝液:在上述洗板液中加3mg/ml的明膠,臨用前新鮮配製。
(9)皁土吸附緩衝液(pH18.95):584mg NaCl與605mg Tris共溶於90ml蒸餾水中。以濃HCl調PH8.95,加入BSA 100mg。
(10)底物緩衝液(pH5.0)由0.05mol/L檸檬酸與0.1mol/L Na2HPO4配成。臨用前稱取10mg鄰苯二胺溶於25ml此液中,加入30%H2O210μl,混勻。
(12)透析型酶標儀。
5.6 操作方法
(1)血漿標本的採集:用塑料注射器順利取靜脈血4.5ml(開始的2ml棄去),加入盛有0.5ml抗凝劑(肝素鈉500u和aprotinin 5000u)的試管中,立即混勻。3000r/min離心20min,分離血漿,吸上層血漿至另一試管,立即作下一步處理或置-20℃保存。
(2)血漿標本的皁土吸附處理:目的是徹底除去纖維蛋白原。40mg皁土加入45ml的聚丙烯塑料離心管中,加入0.5ml吸附緩衝液,充分混勻,加入1ml血漿,在迴旋混合器上震盪混勻,再緩慢震搖10min。5000r/min離心15min,吸取上清液至另一試管,再如上法以皁土吸附處理1次。然後吸取上清液1ml加到一預先盛有20g/LTween20溶液50μl的試管中,混勻。最終標本已稀釋20倍。
(3)FPA包被:取1μg/ml的FPA溶於包被緩衝液中,加入聚苯乙烯反應板,200μl/孔,加蓋,37℃過夜。次日棄孔內液。以洗滌液洗板5次,每次3min,甩幹,備用。
(4)FPA標準品:以標本稀釋緩衝液配成;25,12.5,6.25,3.12,1.56,0.78ng/ml等6個不同濃度。分別吸取0.9ml於一系列小試管中,再在各管中加入0.1ml的工作濃度的兔抗人FPA。經皁土吸附處理的待測血漿標本作原倍、1∶2、1∶4倍3個濃度如上操作。上述各管置37℃反應3h。
(4)從溫育後的上述各管中分別吸取200μl加入已包被的FPA的反應板各孔中,置板於37℃保溫2h,洗板5次,甩幹。
(6)各孔加HRP-羊抗兔IgG(以標本稀釋液稀釋至工作濃度)200μl/孔,置板於37℃溫育2h,洗板5次,甩幹。
(7)各孔加新鮮配製的底物液200μl,37℃避光精確反應3min,各孔立即滴加3mol/L H2SO450μl以終止反應。在酶標上測定各孔的A值(492nm)。
5.7 正常值
1.2±0.8μg/L。RIA法<2μg/L。
5.8 化驗結果臨牀意義
FPA是纖維蛋白原在凝血酶的作用下的降解產物,因此,它是血管內凝血酶生成的標誌。通常將FPA>2μg/L作爲血凝亢進的指標。FPA定量主要用於DIC的早期診斷和DIC抗凝治療的監測試驗。在DIC患者使用肝素開始後,如FPA下降,表明治療有效。也是血栓性疾病、心肌梗塞、冠心病、白血病、腎臟病的診斷指標之一。因爲FPA自腎排泄,故腎功能不良時也增多。FPA在體內的半衰期短,在抗凝療法時其變動出現的也早,所以FPA測定可用於DIC抗凝療法的監護檢查。
血漿FPA含量增高反映凝血系統激活和凝血酶的生成。因此見於高凝狀態和血栓性疾病,原發性和繼發性纖溶的鑑別,抗凝治療過程中的監測指標。