3 培養基及其製備方法
培養基Ｉ
腖 5g 瓊脂 15～20g 牛肉浸出粉 3g 水 1000ml 磷酸氫二鉀 3g
除瓊脂外，混合上述成分，調節pH使比最終的pH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，調節pH值使滅菌後爲7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃滅菌30分鐘。
培養基Ⅱ
腖 6g 葡萄糖 1g 牛肉浸出粉 1.5g 瓊脂 15～20g 酵母浸出粉 6g 水 1000ml
除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節pH使比最終的pH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過,加葡萄糖溶解後,搖勻,調節pH值使滅菌後爲7.8～8.0或6.5～6.6,在115℃滅菌30分鐘。
培養基Ⅲ
腖 5g 磷酸氫二鉀 3.68g 牛肉浸出粉 1.5g 磷酸二氫鉀 1.32g 酵母浸出粉 3g 葡萄糖 1g 氯化鈉 3.5g 水 1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節pH值使滅菌後爲7.0～7.2，在115℃滅菌30分鐘。
培養基Ⅳ
腖 10g 葡萄糖 10g 氯化鈉 10g 瓊脂 20～30g 枸櫞酸鈉 10g 水 1000ml
除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節pH使比最終的pH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，在109℃加熱15分鐘，於70℃以上保溫靜置1小時後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節pH值使滅菌後爲6.0～6.2，在115℃滅菌30分鐘。
培養基Ⅴ
腖 10g 瓊脂 15～20g 麥芽糖 40g 水 1000ml
除瓊脂和麥芽糖外，混合上述成分，調節pH使比最終的pH值略高 0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，加麥芽糖溶解後，搖勻， 調節pH值使滅菌後爲7.2～7.4，按需要分裝，在115℃滅菌30分鐘，趁熱斜放使凝固成斜面。
培養基Ⅵ
腖 8g 磷酸二氫鉀 1g 牛肉浸出粉 3g 葡萄糖 2.5g 酵母浸出粉 5g 瓊脂 15～20g 氯化鈉 45g 水 1000ml 磷酸氫二鉀 3.3g
除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調節pH使比最終的pH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，加葡萄糖溶解後，搖勻，調節pH值使滅菌後爲7.2～7.4,在115℃滅菌30分鐘。
培養基Ⅶ
腖 5g 枸櫞酸鈉 10g 牛肉浸出粉 3g 瓊脂 15～20g 磷酸氫二鉀 7g 水 1000ml 磷酸二氫鉀 3g
除瓊脂外，混合上述成分，調節pH使比最終的pH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，調節pH值使滅菌後爲6.5～6.6，在115℃滅菌30分鐘。
培養基Ⅷ
酵母浸出粉 1g 瓊脂 15～20g 硫酸銨 1g 磷酸鹽緩衝液(pH6.0) 1000ml 葡萄糖 5g
腖
10g
15～20g
5g
肉浸液
1000ml
除瓊脂外，混合上述成分，調節pH使比最終的pH值略高0.2～0.4，加入瓊脂，加熱溶化後濾過，調節pH值使滅菌後爲 7.2～7.4，分裝，在115℃滅菌30分鐘，趁熱斜放使凝固成斜面。
培養基可以採用相同成分的乾燥培養基代替，臨用時，照使用說明配製和滅菌，備用。
磷酸鹽緩衝液(pH6.0) 取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml，濾過，在115℃滅菌30分鐘。
磷酸鹽緩衝液(pH7.8) 取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過，在115℃滅菌30分鐘。
磷酸鹽緩衝液(pH10.5) 取磷酸氫二鉀35g，加10mol/L氫氧化鉀溶液2ml，加水使成1000ml，濾過，在115℃滅菌30分鐘。
菌懸液的製備
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）懸液
取枯草芽孢桿菌［CMCC（B） 63501］的營養瓊脂斜面培養物，接種於盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在35～37℃培養7日,用革蘭氏染色法塗片鏡檢，應有芽孢85％以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，備用。
短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）懸液 取短小芽孢桿菌［CMCC（B）63202］的營養瓊脂斜面培養物，照上述方法製備。
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）懸液
取金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的營養瓊脂斜面培養物,接種於營養瓊脂斜面上，在35～37℃培養20～22小時。臨用時，用滅菌水或0.9％滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。
取藤黃微球菌［CMCC（B）28001］的營養瓊脂斜面培養物，接種於盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在26～27℃培養24小時，或採用適當方法製備的菌斜面,用培養基Ⅲ或0.9％滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。
大腸桿菌（Escherichia coli）懸液
取大腸桿菌［CMCC（B）44103］的營養瓊脂斜面培養物，接種於營養瓊脂斜面上，在35～37℃培養20～22小時。臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，備用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）懸液
取啤酒酵母菌（9763）的Ｖ號培養基瓊脂斜面培養物，接種於Ⅳ號培養基瓊脂斜面上。在32～35℃培養24小時，用滅菌水將菌苔洗下置含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻，備用。
標準品的使用和保存，應照標準品介紹的規定。臨用時照表1的規定進行稀釋。
供試品溶液的製備
精密稱（或量）取供試品適量，用各藥品項下規定的溶劑溶解後，再按估計效價或標示量照表1的規定稀釋至與標準品相當的濃度。
雙碟的製備
取直徑約90mm、高16～17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養基（照表 1）20ml，使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作爲底層。另取培養基適量加熱融化後，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入規定的試驗菌懸液適量（能得清晰的抑菌圈爲度。二劑量法標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm，三劑量法標準品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm），搖勻,在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作爲菌層。放置水平臺上冷卻後，在每1雙碟中以等距離均勻安置不鏽鋼小管（內徑6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外徑7.8±0.1mm）4個（二劑量法）或6個（三劑量法），用陶瓦圓蓋覆蓋備用。
4 檢定法
二劑量法
取照上述方法製備的雙碟不得少於4個,在每1雙碟中對角的2個不鏽鋼小管中分別滴裝高濃度及低濃度的標準品溶液,其餘2個小管中分別滴裝相應的高低兩種濃度的供試品溶液；高、低濃度的劑距爲2：1或4：1。在規定條件下培養後，測量各個抑菌圈的直徑（或面積），照生物檢定統計法中的（2.2 ）法進行可靠性測驗及效價計算。
三劑量法
取照上述方法製備的雙碟不得少於6個,在每1雙碟中間隔的3個不鏽鋼小管中分別滴裝高濃度(S<[3]>)、中濃度(S<[2]>)及低濃度(S<[1]>)的標準品溶液，其餘3個小管分別滴裝相應的高、中、低三種濃度的供試品溶液;三種濃度的劑距爲1∶0.8。在規定條件下培養後，測量各個抑菌圈的直徑(或面積)，照生物檢定統計法(附錄ⅩⅣ)中的(3.3)法進行可靠性測驗及效價計算。
本法計算所得效價，如低於估計效價的90％或高於估計效價的110％時,則應調整其估計效價，予以重試。
除另有規定外，本法的可信限率不得大於5％。
表1 抗生素微生物檢定試驗設計表 ━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━┯━━━┯━━━━━┯━━━━━━━━━━━ │ │ 培 養 基 │ 滅菌 │抗生素濃度│ 培養條件 抗生素類別 │ 試 驗 菌 ├───┬─────┤緩衝液│ 範 圍 ├─────┬───── │ │ 編 │ pH值 │pH值 │ │ 溫 度│ 時 間 │ │ 號 │ │ │ 單位/ml │ ℃ │ 小 時 ───────┼───────────────┼───┼─────┼───┼─────┼─────┼───── 鏈黴素 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.6～1.6 │ 35～37 │ 14～16 卡那黴素 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16 阿米卡星 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16 巴龍黴素 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16 核糖黴素 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 2.0～12.0│ 35～37 │ 14～16 捲曲黴素 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │10.0～40.0│ 35～37 │ 14～16 磺苄西林 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅰ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 5.0～10.0│ 35～37 │ 14～16 去甲萬古黴素│枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅷ │ 6.0 │ 6.0 │ 9.0～43.7│ 35～37 │ 14～16 頭孢噻肟鈉 │枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501] │ Ⅶ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 0.5～2.2 │ 35～37 │ 14～16 慶大黴素 │短小芽孢桿菌[CMCC(B) 63202] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 2.0～12.0│ 35～37 │ 14～16 紅黴素 │短小芽孢桿菌[CMCC(B) 63202] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │ 5.0～20.0│ 35～37 │ 14～16 新黴素 │金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003] │ Ⅱ │ 7.8～8.0 │ 7.8②│ 4.0～25.0│ 35～37 │ 14～16 四環素 │藤黃微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18 土黴素 │藤黃微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18 美他環素 │藤黃微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18 金黴素 │藤黃微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 4.0～25.0│ 35～37 │ 16～18 多西環素 │藤黃微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 4.0～25.0│ 35～37 │ 16～18 氯黴素 │藤黃微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │30.0～80.0│ 35～37 │ 16～18 桿菌肽 │藤黃微球菌[CMCC(B) 28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │ 2.0～12.0│ 35～37 │ 16～18 粘菌素 │大腸桿菌[CMCC(B) 44103] │ Ⅵ │ 7.2～7.4 │ 6.0 │ 614～2344│ 35～37 │ 16～18 兩性黴素B ①│啤酒酵母菌 (9763) │ Ⅳ │ 6.0～6.2 │10.5 │ 0.5～2.0 │ 35～37 │ 24～36 ━━━━━━━┷━━━━━━━━━━━━━━━┷━━━┷━━━━━┷━━━┷━━━━━┷━━━━━┷━━━━━ ① 兩性黴素B雙碟的製備，用菌層15ml代替兩層。 ② 含3％氯化鈉。 表2 抗生素標準品品種與理論值 ┏━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━┓ ┃ 標準品品種 │ 標準品分子式或品名 │理論計算值 u/mg ┃ ┠───────┼────────────────┼────────┨ ┃鏈黴素 │(C21H39N7O12)2·3H2SO4 │ 798 ┃ ┃卡那黴素 │C18H36N4O11·H2SO4 │ 831.6 ┃ ┃阿米卡星 │C22H43N5O13 │ 1000 ┃ ┃核糖黴素 │C17H34N4O10·nH2SO4(n<2) │ ┃ ┃新黴素 │硫酸新黴素 │ ┃ ┃慶大黴素 │硫酸慶大黴素 │ ┃ ┃磺苄西林 │C16H16N2Na2O7S2 │ ┃ ┃頭胞噻肟鈉 │C16H16N5NaO7S2 │ 951.85 ┃ ┃四環素 │C22H24N2O8·HCl │ 1000 ┃ ┃土黴素 │C22H24N2O9·2H2O │ 927 ┃ ┃美他環素 │C22H22N2O8·HCl │ 923.86 ┃ ┃金黴素 │C22H23ClN2O8·HCl │ 1000 ┃ ┃多西環素 │C22H24N2O8HCl·1/2C2H5OH·1/2H2O│ 866.45 ┃ ┃紅黴素 │C37H67NO13 │ 1000 ┃ ┃氯黴素 │C11H12Cl2N2O5 │ 1000 ┃ ┃桿菌肽 │杆肽菌 │ ┃ ┃粘菌素 │硫酸粘菌素 │ ┃ ┃去甲萬古黴素 │C65H73Cl2N9O24·HCl │ 975.23 ┃ ┃捲曲黴素 │硫酸捲曲黴素 │ ┃ ┃兩性黴素B │C47H73NO17 │ 1000 ┃ ┗━━━━━━━┷━━━━━━━━━━━━━━━━┷━━━━━━━━┛