2 前言
由病毒、細菌或其他病原微生物爲起始材料，經培養增殖等製成的減毒、滅活的病原體，或再經分離、提取等方法製備的富含免疫原性組份（亞單位），免疫機體後可誘導產生特異性免疫應答而達到預防某種疾病的產品，爲預防用疫苗。
4 二、用於疫苗生產的菌毒種
疫苗生產用菌毒種必須證明爲引起相應疾病的細菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，應明確提供以下信息：
（一）菌毒株名稱及來源
1.菌毒株名稱。
2.菌毒株來源：
（1）菌毒株來源的宿主一般情況。
（2）發病地點、發病日期；臨牀確診疾病名稱及日期、實驗室確診的主要依據、檢測項目、結果及日期；病人病程及轉歸。
3.菌毒株分離樣本來源：咽拭子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、組織標本。取樣日期；取樣時病人的病期。應提供病人治療期間使用的主要藥物包括抗生素、抗病毒藥物的劑量和療程等資料。鑑於人類的血液、腦脊液等在同一時間內相對較少感染多種病毒或細菌，因此用病人血液等分離的菌、毒株較適宜用於疫苗的研發和生產。
（二）菌、毒株分離過程
1.病毒分離用細胞名稱、代次、來源應清楚，應進行無菌、支原體和外源因子等檢測；病毒分離不得使用腫瘤原性的細胞系，應使用非腫瘤原性細胞，如原代細胞、人二倍體細胞或Vero細胞等。
2.病毒分離用動物名稱、品系、級別、年齡、接種途徑、飼養條件和製備毒種的動物臟器名稱等需詳細記載；如再適應到細胞，應參照上述對病毒分離用細胞的要求。
3.菌毒株分離用培養基名稱、種類，以及分離培養的溫度和條件需確定。
應包括樣品處理方法、確證菌毒株首次陽性的代次、菌毒株檢定方法、每代培養條件、滴度、滴定方法、動物是否發病或死亡等資料。
（四）菌毒種庫的建立和保存
原始種子批是指已適應到可生產疫苗的細胞或培養基，可穩定傳代、具有良好的免疫原性、並經過檢定可用於疫苗生產的菌毒種。應提供原始菌毒種代次、滴度，添加的保護劑的名稱和濃度、存儲條件等資料。種子批的建立應符合現行版《中國藥典》“生物製品製品生產檢定用菌毒種管理規程”的要求，應對種子批進行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子和工作種子批在規定代次內的生物學特性與原始菌毒種的一致性。
1.應提供候選菌毒種研究資料
在建立原始菌毒種庫前應考慮候選菌毒種的研究：包括收集不同地區的（不同地域、發病率和民族）、不同時期的（近年與往年）、不同年齡和性別、疾病不同症狀或嚴重程度、不同樣本採集方式或來源（如血液、腦脊液、咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等）的至少10個以上菌毒株進行生物學等研究和比較，分析其異同點，爲建立菌毒種庫提供依據。
2.三級種子庫建立的研究資料
選擇由多個候選菌毒種篩選獲得的有代表性的2-3株菌毒種，用適宜的方法進行毒株的純化，如空斑形成試驗，挑取遺傳穩定性與原始種子一致的，至少在主要保護區域核苷酸及氨基酸序列一致的毒株。同時進行三級種子批建立和工藝適應性、免疫原性和免疫效果比較研究。分析在種子批建立傳代過程中不同菌毒種的遺傳穩定性、病毒滴度及免疫原性資料；比對不同菌毒種對發酵、培養、收穫、純化等生產工藝和滅活工藝的適應性；考覈不同菌毒種的免疫原性和免疫效果；對不同菌毒種的交叉保護水平和能力進行比較研究，確定交叉保護範圍廣、誘導免疫應答能力強的毒株。通過以上研究結合疫苗配方探討，綜合判斷、確定應用於疫苗生產的最佳菌毒株。
原始種子、主種子、工作種子及疫苗代次的毒株遺傳穩定性應保持一致。
（五）菌毒種的檢定
1.鑑別試驗：可採用血清學、生物學、核酸序列分析等方法證明爲該菌毒種。明確該病原體及其它相關生物分子的基因序列及結構，並與我國主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對該種基因型或血清型的流行情況進行分析，若存在不同的血清型或基因型，應對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應或交叉保護性進行分析和研究。對某些病原體，即使菌毒株爲同一基因型或同一血清型，也應對不同菌毒株的抗原性、免疫原性以及交叉保護能力進行比較。
2.純菌檢查：按照現行版《中國藥典》的要求進行，應符合規定。
3.外源因子檢查：按照現行版《中國藥典》的相關要求進行，應符合規定。
4.感染性滴度：應能達到按生產工藝要求順利生產合格疫苗的要求。應建立測定菌毒種感染性滴度的方法和標準，並提供這些感染性滴度與疫苗有效性之間的相關性數據。
5.免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標，應制定和建立測定菌毒種免疫原性的有效方法和標準，以評估該候選菌毒種能否進行疫苗生產。
6.減毒特性
（1）如研製減毒活疫苗應對原始菌毒株的生物學、血清型、基因型和免疫原性進行研究；應提供減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒後的生物學、血清型、基因型和免疫原性及減毒穩定性資料，並進行減毒前後的特性對比，尤其要對減毒後的安全性和免疫原性做出確切的結論。
（2）應建立減毒特性指標的驗證方法、動物模型和減毒後安全性的標準以及檢測方法和警戒毒力回覆的依據等。
（3）注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測外，還應驗證無逆轉錄病毒的污染。該驗證方法可採用PERT法等。
（4）如已知該病毒具有嗜神經毒性，其驗證要求可參考《IABSScientificworkshoponneurovirulencetestforlivevirusvaccines，WHO，31January2005》。
5 三、疫苗的生產工藝研究
確定工作種子批和疫苗代次的菌毒株主要保護區域核苷酸及氨基酸序列在傳代過程中發生改變的頻率。生產用菌毒種、細胞和涉及生產的工藝技術應注意專利，應進行相關專利查詢。
1.生產用細胞應符合現行版《中國藥典》中“生物製品生產檢定用動物細胞基質製備及檢定規程”的要求，除原代細胞外，採用其他細胞系應建立細胞庫。
2.生產用培養基儘可能避免使用動物來源和可能引起人體不良反應的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區的牛源性原材料。
（三）疫苗生產工藝的研究
生產工藝需進行驗證。對疫苗生產中菌毒種代次、菌毒種接種量、收穫次數、滅活工藝及驗證、半成品配製、分批等要求，應按現行版《中國藥典》執行。
1.原液生產的主要技術參數的確定
（1）病毒與細胞的接種比例或者MOI的最佳參數、細胞培養和病毒培養的最佳溫度、培養時間和收穫時間等條件。菌毒種的接種量、培養和發酵條件等技術參數。
（2）滅活劑的選擇和依據。
（3）滅活、裂解、減毒或脫毒效果的驗證。效果驗證的依據、方法，應採用儘可能敏感的細胞或培養基和方法進行。
（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：應對純化和提取工藝中各種條件進行優化，確定純化和提取工藝對抗原活性成分是否影響；應建立穩定的純化工藝，包括純化時的回收率、抗原活性和純度等的穩定性，並制定相應的質控指標和檢測方法。
2.對佐劑的要求
新型疫苗應用的佐劑包括3類：分別爲目前常用的鋁佐劑；批准用於某些疫苗的佐劑如MF59等；新開發研製尚未用於疫苗特別是預防性疫苗的佐劑如CpG等。一般情況下，抗原量及免疫原性能滿足免疫保護的需要，則不使用佐劑爲宜。
（1）是否選擇鋁佐劑，應根據疫苗抗原的免疫原性、抗原與佐劑最優配比等綜合考慮。應注意不同種類抗原與鋁佐劑製備疫苗後，鋁佐劑對抗原的免疫增強作用可能有所差異，甚至不同製備批的鋁佐劑之間也有不同。
（2）對其他已經批准用於上市疫苗的佐劑，只需提供該類製劑的組分或化學組成，國內外使用該類製劑的情況，無需對該佐劑再單獨進行毒理和安全性研究，但應對疫苗成品進行嚴格的安全性研究，獲得新型疫苗中佐劑的安全性資料。
（3）若國內外均未使用過該類佐劑，則必須對其作用原理、安全性及佐劑效應進行詳細的研究並建立切實可行的評價方法。
（四）疫苗的配方研究
6 四、藥理、毒理和生物分佈
疫苗不同於一般的化學藥品，藥理、毒理的試驗要求具有特殊性。由於各項藥理、毒理試驗是互相關聯的，因此在試驗和評價時應綜合考慮相關的因素。
藥理學試驗主要包括疫苗的作用機理和免疫原性。應建立適當的試驗方法評價疫苗的免疫原性。如果有動物模型或可建立動物模型，可以採用動物模型直接評價疫苗的免疫原性。對一些有動物模型的感染性疾病，可以採用病原體的攻擊試驗評價該疫苗的保護效果。若無法建立動物模型，應建立能驗證該疫苗有效性的體外試驗進行評價。應考察接種的劑量與免疫原性的關係，通過試驗優化免疫程序和接種途徑。
疫苗的動物長期毒性試驗及毒理學試驗應選用相關種屬或品系的動物進行，至少選擇一種相關動物進行毒性試驗。試驗內容主要包括重複給藥毒性試驗、急性毒性試驗、局部刺激性試驗等，必要時還應包括生殖毒性試驗。接種劑量原則上應使疫苗在動物體內達到最佳的免疫應答。疫苗的動物長期毒性試驗不需要每日給藥，接種次數建議至少比臨牀擬定的接種次數多1次，一般採取2～3周的暴露間隔。試驗應考察接種部位和全身的病理反應，應儘可能進行疫苗的免疫原性試驗，包括血清中和抗體效價或其它與免疫應答有關的研究，重點考察疫苗誘導的免疫毒性作用，需關注對疫苗誘導的保護性細胞因子和與毒性有關的炎症因子的檢測和分析。
疫苗通常不需要進行藥代動力學研究。必要時，應建立敏感的動物模型考察減毒活疫苗的生物分佈，測定接種疫苗後的病毒血癥（或菌血症）以及持續時間、排毒（菌）方式和途徑，對是否呈現體內複製及器官組織的感染應進行研究。
7 五、質量控制要求
在生產工藝的各個環節和步驟中的產品均應建立相應的監控標準，以便後續工藝的進行，保證產品的質量、工藝的穩定性。應在研發階段建立疫苗的質控標準和參考品，應建立並驗證純度、雜質殘留、抗原、抗體、生物效力的定量檢測方法；單劑疫苗不應添加含汞防腐劑。疫苗生產在培養階段不得添加抗生素。對種子培養階段添加抗生素的應按現行版《中國藥典》的標準執行。
1.工作種子批毒種製備階段應重點關注其遺傳穩定性，建立鑑別試驗、病毒滴度檢查、毒株免疫原性試驗的方法和標準。
2.對純化工藝應重點關注其純化產物、原液的抗原純度，建立用於評價純化產物所含有效成分的最低限量和雜質的最高限量方法，通常可測定有效抗原在疫苗中的絕對值或測定主要雜質的量推算有效抗原在疫苗中的相對值。採用人二倍體細胞以外的細胞生產的，應建立用於評價純化產物、原液中宿主細胞DNA和蛋白殘留量的方法。對生產過程中使用滅活劑的疫苗，應建立有效的滅活方法，對滅活效果進行驗證；建立用於評價純化產物、原液、成品中滅活劑殘留量檢測的方法。建立上述檢測方法時應建立相應的標準品，並按藥典中有關方法學驗證指南對方法、試劑、標準品的敏感性和特異性等進行驗證，並制定相應的限量範圍，以達到控制生產批間的一致性和產品質量穩定性的目的。
3.申報疫苗的質量標準不得低於現行版《中國藥典》和WHO相關指南的要求。對於能夠定量檢測的安全性、有效性的指標，其質量標準應根據多批（有統計學意義的）產品，多次測定的試驗數據，經統計學分析後擬定，計算均值和標準差，應綜合考慮方法學的變異情況，確定合理的上下限要求，一般均值加減不得高於2.58個標準差作爲上下限。
（1）鑑別試驗、裝量。
（4）生物效價：應建立體內或體外檢測方法和標準。體內效力試驗一般採用小鼠ED50的方法。由於用於預防的疫苗是通過機體的免疫應答反應發生作用的，因此應評價其體液免疫和細胞免疫水平。在評價體液免疫效價時，應選擇實驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的檢測方法，並對該類方法進行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體滴度，如有必要和可行，還應當建立評價抗體質量的方法，對抗體的性質進行評價，如亞型測定及抗原中和位點分析等；在評價細胞免疫效價時，可建立檢測評價細胞免疫的方法（如Elispot方法等），也可通過對細胞因子的定量檢測評價其細胞免疫情況，如屬於常規檢定項目，方法應穩定、重複性好、可操作性強，並制定相應的質量標準。若有動物模型，可進行動物保護性試驗。
5.疫苗標準品或參考品的研究：應在疫苗研發階段考慮研究、建立穩定工藝後的疫苗抗原參考品，以及疫苗效力、免疫原性檢測的標準品或參考品。疫苗抗原參考品與其後生產多批次疫苗的質量控制指標的比對，可瞭解在上市後生產的疫苗抗原較研發階段的抗原在質量上有無改變。疫苗效力、免疫原性檢測的標準品或參考品可用於疫苗效力指標的質量控制。
8 六、穩定性試驗
穩定性試驗是指疫苗在規定保存溫度下的穩定性試驗。由於穩定性試驗的結果直接與製品的效期有關，且試驗觀察時間較長，因此應在生產工藝確定後儘早留樣進行，定期取樣測定製品效力和其他相關的質量指標。對穩定性試驗結果與加速穩定性試驗數據進行分析對比，可爲正式產品的有效期確定提供依據。