3 布氏菌純蛋白衍生物藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Bushijun Chundanbai Yanshengwu
3.1.3 英文名
Purified Protein Derivative Of Brucellin（BR-PPD）
3.2 定義、組成及用途
本品系用布氏菌經培養、殺菌、除去菌體後的上清液製成的純蛋白衍生物，用於布氏病的臨牀診斷、布氏菌苗接種對象的選擇及布氏菌苗接種後機體免疫反應的監測。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
布氏菌純蛋白衍生物（BP-PPD）生產車間必須與其他生物製品生產車間及實驗室分開，原液生產全部過程，包括布氏桿菌的滅活，應在完全隔離的區域內進行，所需設備及器具均須單獨設置並專用。直接用於生產的金屬或玻璃等器具，應經過嚴格清洗及滅菌處理。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 菌種
生產用菌種應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”的有關規定。
3.4.1.1 2.1.1 名稱及來源
採用豬布氏菌Ⅰ型CMCC 55007 （S2）菌株。
3.4.1.2 2.1.2 種子批的建立
3.4.1.3 2.1.3 種子批的傳代
3.4.1.4 2.1.4 種子批的檢定
3.4.1.4.1 2.1.4.1 染色鏡檢
3.4.1.4.2 2.1.4.2 生化反應
3.4.1.4.3 2.1.4.3 血清學特性
生產用菌種對布氏菌參考血清的凝集效價應達到1:800（++）以上。
3.4.1.4.4 2.1.4.4 噬菌體裂解特性
能被布氏菌Wb噬菌體裂解。
3.4.1.5 2.1.5 種子批的保存
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 生產用種子
啓開菌種後接種於肝瓊脂斜面培養基，置37℃培養2～3天，根據生長情況，可在肝瓊脂斜面培養基上再傳代1次，生長良好的菌苔，用於生產。
3.4.2.2 2.2.2 生產用培養基
3.4.2.3 2.2.3 接種和培養
取2.2.1項生長良好的菌苔，接種於適量的大管肝斜面或克氏瓶中，置37℃培養2天作爲種子，再接種至大管肝斜面或肝瓊脂克氏瓶，置37℃培養2天。
3.4.2.4 2.2.4 收穫及殺菌
培養終止，以生理氯化鈉溶液洗脫培養物，121℃、30分鐘殺菌，殺菌後離心除去菌體，收集上清液。如上清液需保存應加入3.0g/L苯酚或其他適宜的防腐劑，保存於2～8℃，保存期不超過30天。應防止凍結。
3.4.2.5 2.2.5 純化
收集上清液進行純化。用三氯乙酸和飽和硫酸銨法分別沉澱蛋白質，或採用經批准的方法純化，除菌過濾後即爲原液。
3.4.2.6 2.2.6 合併與分裝及凍幹
3.4.2.6.1 2.2.6.1 合併
同批分次純化的原液可以合併，但不得超過5次。
3.4.2.6.2 2.2.6.2 分裝及凍幹
原液檢定合格後，可根據蛋白質含量，將原液稀釋至規定濃度，定量分裝，分裝後立即進行凍幹。
3.4.2.7 2.2.7 原液檢定
按3.1項進行。
3.4.2.8 2.2.8 保存及有效期
原液應保存於2～8℃。液體原液自效價測定合格之日起，有效期爲5年；原液凍幹品自效價測定合格之日起，每間隔5年應按3.1項進行檢定，合格後可繼續使用。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 配製
經檢定合格的原液，用0.01mol/L PBS（ pH7.2～7.4，含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚）稀釋至20IU/ml或50IU/ml。
3.4.3.2 2.3.2 半成品檢定
按3.2項進行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分裝
3.4.4.3 2.4.3 規格
每瓶1ml、2ml。每1次人用劑量0.1ml，含BR-PPD 1IU。
3.4.4.4 2.4.4 包裝
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 原液檢定
3.5.1.1 3.1.1 外觀
原液凍幹品應爲白色疏鬆體。液體原液及凍幹品復溶後應呈棕黃色澄明液體，無不溶物或雜質。
3.5.1.2 3.1.2 復溶時間
3.5.1.3 3.1.3 水分
凍幹品應不高於3.0%（2010年版藥典三部附錄Ⅶ D）。
3.5.1.4 3.1.4 純度
3.5.1.4.1 3.1.4.1 蛋白質含量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B第二法）。
3.5.1.4.2 3.1.4.2 多糖與核酸含量（2）核酸含量測定 量取供試品2～3ml，採用紫外一可見分光光度法（附錄Ⅱ A），在波長260nm處測定吸光度，按=200計算核酸含量。
3.5.1.5 3.1.5 效價測定
3.5.1.5.1 3.1.5.1 動物法
將標準品及本品分別稀釋3個不同稀釋度，取至少4只經布氏菌致敏的體重爲400～600g的白色雌性豚鼠，去毛後於背部脊柱兩側相對部位，分別皮內注射上述稀釋度本品各0.1ml或0.2ml，於注射後24小時、48小時各觀察局部硬結的縱徑與橫徑（可根據48小時的反應結果判定）。計算每個稀釋度2天的硬結反應總和或平均面積，並求其比值，每個稀釋度本品與相應濃度標準品的比值應爲0.8～1.2，如不符合上述要求，可調整稀釋度後再測定效價，直至符合要求。
3.5.1.5.2 3.1.5.2 稀釋度選擇
稀釋度的選擇應能使本品注射後24小時所產生的局部硬結反應直徑爲10～30mm;本品和標準品的硬結反應直徑大小應相似，且本品和標準品的3個稀釋度的劑量對數反應曲線應基本平行。如本品效價與標準品效價不一致，可用同樣方法複試1次，並算出相當於標準品的效價，進行調整，調整後再重新抽樣測定效價，直至符合要求。
3.5.1.6 3.1.6 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.1.7 3.1.7 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F），應符合規定。
3.5.1.8 3.1.8 致敏效應試驗
試驗組與對照組分別選用體重300～400g未做過任何試驗的豚鼠各3只。試驗組每隻豚鼠皮內注射0.2ml含20μg的本品，共3次，每次間隔5天。在第3次注射後15天，試驗組與對照組每隻豚鼠各皮內注射0.2ml含20μg的本品，連續觀察3天，兩組動物反應應無明顯區別。
3.5.2 3.2 半成品檢定無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.3 3.3 成品檢定
3.5.3.1 3.3.1 鑑別試驗
取經布氏菌致敏的豚鼠至少4只，皮內注射0.2ml本品，24小時後豚鼠的平均硬結反應直徑（縱、橫直徑相加除以2）均應不小於5mm。
3.5.3.2 3.3.2 物理檢查
3.5.3.2.1 3.3.2.1 外觀
應爲無色澄明液體，無不溶物或雜質。
3.5.3.2.2 3.3.2.2 裝量
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ A），應不低於標示量。
3.5.3.3 3.3.3 化學檢定
3.5.3.3.1 3.3.3.1 pH值
應爲6.8～7.4（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.5.3.3.2 3.3.3.2 苯酚含量
應不高於3.0g/L（2010年版藥典三部附錄Ⅵ M）。
3.5.3.4 3.3.4 效價測定
取經布氏菌致敏的400～600g豚鼠，皮內注射0.2ml標準品與本品，至少各4只，注射後24小時、48小時各觀察結果1次（可根據48小時的反應結果判定），計算本品和標準BR-PPD的平均硬結反應直徑，計算累計值，並求其比值，應爲0.8～1.2。
3.5.3.5 3.3.5 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.3.6 3.3.6 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F），應符合規定。
3.6 4 保存、運輸及有效期
3.7 5 使用說明
3.8 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版