3 載脂蛋白AⅡ測定
3.1 檢查名稱
3.2 分類
3.3 原理
（1）免疫透射比濁法的原理是：血清apoA-Ⅱ與試劑中的特異性抗人apoA-Ⅱ抗體相結合，形成不溶性免疫複合物，使反應液產生混濁，以光度計在波長340nm測出吸光度，代表混濁程度，濁度高低反映血清標本中apoA-Ⅱ的含量，後者可由校準血清所作校準曲線讀出。
試劑中聚乙二醇（PEG）有促進抗原抗體反應的作用。apoA-Ⅱ主要存在於HDL顆粒表面，血清稀釋及表面活性劑有助於HDL apoA-Ⅱ抗原位點的暴露，使之能充分地與特異性抗體起反應，表面活性劑還可減輕血清空白濁度。
（2）火箭電泳法的原理是：火箭免疫電泳法是單向免疫擴散法的一種改進，通過應用直流電（穩壓穩流）使抗原（apoA-Ⅱ和B）在含有特異性抗體的瓊脂糖凝膠中擴散，pH 8.6時抗原向陽極移動，在泳動途中與凝膠中的抗體反應，逐漸形成類似火箭的沉澱峯。其峯高（或峯面積）與抗原濃度成正比，故可作抗原定量。
3.4 試劑
①樣品稀釋劑：pH 7.4的磷酸鹽緩衝液（0.01mol/L磷酸鹽中含0.15mol/L氯化鈉），內含PEG-6000 40g/L及表面活性劑適量（選用聚氧乙烯月桂醚類，如Thesit或Tween-20），用GS玻芯漏斗抽濾後用。本試劑的吸光度A340nm＜0.05，在2～6℃冰箱中可存放半年。如半年後A值仍＜0.05，可繼續應用，如＞0.05可按上述條件抽濾後再用。
②羊或兔抗人apoA-Ⅱ抗血清：原血清效價以1∶32～1∶64爲宜。抗血清可用含PEG-6000的磷酸鹽緩衝液（不含表面活性劑）或用硫酸銨沉澱法純化。抗血清應用液濃度因各批抗血清的效價及免疫親和力而異（應按試劑盒介紹，臨用前稀釋）。抗血清中含防腐劑，在2～6℃冰箱中可存放半年。原血清（凍幹）在低溫冰箱中（－20℃以下）可貯存數年。
③參考血清：現在已有國際標準，即WHO apoA-Ⅱ參考物質SPI-01（凍幹血清）。符合國際標準的校準血清由衛生部北京老年醫學研究所提供。
校準血清保存在－20℃以下，至少穩定半年，化凍後必須徹底混勻後才能應用。最好備有高、中、低濃度（例如apoA-Ⅰ 2.0，1.3與0.6g/L左右）的校準血清各1份。便於作校準曲線。
（2）火箭電泳法：
②10g/L瓊脂糖（標準電內滲）用巴比妥緩衝液配製，加熱溶化，混合後，分裝10ml/管，冷後4℃貯存。
③0.15mol/L NaCl溶液。
④兔（或羊）抗人apoA-Ⅰ抗血清（效價不低於1∶16）及apoB抗血清（效價不低於1∶32）。
⑥染色液：考馬斯亮藍R-250 0.25g溶於甲醇45ml中，加入冰醋酸10ml及水45ml，混合，溶後備用。
3.5 操作方法
①標本應是及時分離的空腹血清，可密封存放在2～6℃冰箱中，1周內測定，－20℃可存放半年。
②用全自動分析儀時，應根據不同儀器設計參數，合理選擇抗原抗體比例及反應時間。也可作速率法散射比濁測定apoA-Ⅱ如用Beckman比濁儀ICS或protein array system）。
③手工法所用儀器：精密光度計，具有340nm濾光片（或分光器），樣品池體積以0.5ml爲宜（爲節省抗血清），最好用流動杯，樣品稀釋最好用稀釋器、經校正的加樣器。
④標本處理：將血清標本及質控血清各用樣品稀釋劑作1∶200稀釋，即先作1∶20稀釋（5.Oμl血清＋95μl稀釋劑）後，再作1∶10稀釋（多餘的1∶20血清作測定apoB用）。然後按表1操作。
質控同上處理。
混勻後，25～37℃放置30min，在波長340nm比濁，根據U-UB的A值，在標準曲線上讀出結果。
本法批間CV＜5%。
⑤校準曲線：在手工與半自動操作中每批測定均需作校準曲線，可將校準血清稀釋成1∶100、1∶200、1∶300和1∶400等4種濃度，與標本同樣操作，根據定值計算出每個標準管apoA-Ⅱ濃度，以濃度（X）與其相應的A值（Y）作圖（用直線迴歸計算），基本上成直線，但在Y軸上有一定截距，所以不能用單點標準。操作準確時濃度與A值的相關係數應在0.985以上。
如有高、中、低濃度的三份校準血清時，可與標本同樣操作，做三點定標，也可作五點定標（即高、中濃度的血清等量混合，及中、低濃度的血清等量混合，成爲另兩份校準血清）。
本法線性範圍：0.4～2.5g/L。
（2）火箭電泳法：
①澆板：每板用10g/L瓊脂糖10ml，沸水浴中融化，混勻，冷至50～55℃時加入apoA-Ⅱ抗血清50μl，apoB抗血清8μl（用量視抗血清效價而定），迅速混勻後倒在預置在水平臺上的玻璃板上，冷後放在4℃，20min後打孔，孔在板的陰極端，孔徑3mm，孔間距至少5mm，孔容量5μl。把板放入電泳槽，用濾紙搭橋。
②稀釋抗原：用0.15mol/L NaCl液將校準血清稀釋成1∶100，1∶150，1∶200，1∶300，及1∶400（作校準曲線之用），血清標本按1∶200稀釋，放4℃冰箱不得超過3天。
③加樣：在低電流狀態（10mA/板）將稀釋好的定值血清及標本分別吸取5μl（準確），加入瓊脂糖凝膠加樣孔內。每板都要做一系列標準。
④通電：穩流24mA/板，端電壓6～8V/cm，以流水冷卻使瓊脂糖保持15℃，電泳3～4h。
⑤脫雜蛋白及制幹膠膜：電泳後的瓊脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min，將膠膜託置於聚酯薄膜上，用多層濾紙在輕輕加壓下吸乾膠內水分，然後將濾紙、膠膜與聚酯膜三者一起自然乾燥，或用熱吹風器吹乾，幹後膠膜會自然與濾紙及聚酯膜分開。
⑦脫色：用脫色液浸泡已染色的膠膜至火箭峯清晰，背景基本無色。可在水中用兩片玻璃紙將膠膜夾住，晾乾後可長期保存。也可以用流水浸泡脫色至背景乾淨。
3.6 正常值
250～520mg/L。
3.7 化驗結果臨牀意義
降低：冠心病、糖尿病、腎病綜合徵、遺傳性ApoA-Ⅰ缺乏症（Tangier病）、家族性低α-脂蛋白血症、魚眼病、重度營養不良、肝炎活動期、肝功能低下。
3.8 附註
①關於抗血清：比濁測定與其他方法相比對抗血清的要求更高。比濁法以用多克隆抗體爲宜。抗血清中必須不含雜抗體。必須十分重視從人血清中提取的apoA-Ⅱ達到免疫純、色譜純與電泳純，這不是一般實驗室都能做到的。抗血清效價（滴度）不可低於16。目前國內某些商品試劑中，apoA-Ⅱ抗血清效價極低，選購試劑盒時必須注意。如果沒有在選購前鑑定抗血清質量的經驗，應請有條件的單位鑑定之。
②上法中標本（血清）稀釋200倍是爲了便於手工操作（加樣100μl），如有精密加樣器，可作20倍稀釋（用10μl）。爲了適合不同實驗室的條件（如不同類型的自動化儀器），作適當修改時應注意抗原抗體的比例，必須十分注意反應體系中不可有抗原過量，線性上限不可低於2.5g/L。換言之，抗血清用量必須充裕，否則標本中apoA-Ⅰ高水平時測出結果偏低。目前國內某些商品試劑盒不但抗血清效價過低，操作中所定標本用量又過大（如3～5μl），抗體明顯不足，測出結果必然不準確。
③爲了達到準確測定的目的，apoA-Ⅱ與B比濁測定（終點法）中必須作校準曲線計算結果。一定範圍（低標本用量）濃度（X）與濁度（Y）基本上成直線關係，直線迴歸計算出在Y軸上有一定截距（A值＜0.1），所以用單點校準計算結果偏差較大，使測出結果不能準確反映濃度的高低（高的偏低，低的偏高）。千萬不要因爲單點法簡便而忽略了測定的準確性。無論用何種自動化儀器，必須先試作校準曲線。如果在所用儀器及特定條件下反覆測試，迴歸線的截距不明顯時，才能採用單點校準法。標本用量在3～5μl時，即使加大抗血清用量，濃度與濁度也不成直線關係，只能用曲線直線化轉換後計算。
④主要干擾因素是血清本身的混濁（如高脂血清），用超離心或脂肪酶水解等標本預處理方法都不實用。用表面活性劑消濁的作用也有限，所以在測定中必須作標本空白管。除了自動分析中可採用兩點法外，手工法用單一試劑而不扣除標本空白的做法是錯誤的。爲了減少基質效應對濁度反應的影響，必須用定值血清作校準物。此外，塵埃粒子、比濁皿劃痕等干擾也必須排除。
⑤有的商品試劑盒（包括某些進口產品）所附校準血清定值不準確，是誤差的重要來源。
（2）火箭電泳法：
①抗原稀釋倍數與抗血清用量的選擇，應以火箭峯清晰、校準曲線斜率適中併成直線爲宜。本法同時測定apoA-Ⅱ與apoB，應調整兩種抗血清用量，使二者峯高有區別，apoB峯高不小於1cm。
②不同種類來源的抗血清（如兔與羊），在等效價的情況下進行試驗，結果會有差異。apoA-Ⅰ測定以兔抗血清爲好。用兔血清時峯形尖細，而羊血清所產生的峯粗，峯尖圓鈍，有時在峯頂前出現虛影。校準血清所作校準曲線斜率也不同。但不論用何種抗血清，定量結果差別不大。
③在一定條件下電泳，不同稀釋度校準血清的峯高不會有明顯變動，校準曲線斜率基本一致。如標本峯高超出校準曲線範圍時，應調整標本稀釋倍數後重測。板間CV通常小於5%。
④火箭電泳結果可以用染色法或直接肉眼觀察可見的火箭峯。前者用標本少，節省抗血清，但如適當增加標本及抗血清用量，不染色更爲方便。所用瓊脂糖應爲標準電滲或低電滲的，凝膠中加入適量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峯更清晰。
⑤火箭峯的測量可以計算面積或峯高，面積是峯高乘以峯寬（峯半高處的寬度）。測量精度最好能達0.1mm。須用機械或電子放大設備。標準曲線範圍內峯高以1～4cm爲宜。
⑥本法適用於少量標本分析。也適用於apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp（a）測定。
3.9 相關疾病
血漿脂蛋白