3 基本信息
ICS 11.020
C 62
中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 571—2017《裂頭絛蟲幼蟲檢測》（Detection of diphyllobothroid larvae）由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會2017年8月1日《關於發佈〈釘螺調查〉等9項推薦性衛生行業標準的通告》（國衛通〔2017〕11號）發佈，自2018年2月1日起實施。
4 發佈通知
關於發佈《釘螺調查》等9項推薦性衛生行業標準的通告
國衛通〔2017〕11號
現發佈《釘螺調查》等9項推薦性衛生行業標準，其編號和名稱如下：
上述標準自2018年2月1日起施行。
特此通告。
國家衛生計生委
2017年8月1日
5 前言
本標準依據GB/T 1.1—2009給出的規則起草。
本標準起草單位：中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所、上海出入境檢驗檢疫局、上海市疾病預防控制中心。
本標準起草人：陳韶紅、李樹清、張小萍、許學年、盧豔、蔡玉春、張永年、李浩、艾琳、鄭彬。
6 標準正文
6.1 1 範圍
本標準適用於各級疾病預防控制機構、醫療機構和食品檢測機構對魚、蛙和蛇中裂頭絛蟲幼蟲的檢測。
6.2 2 規範性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GB/T 18088 出入境動物檢疫採樣標準
6.3 3 術語和定義
下列術語和定義適用於本文件。
3.1
裂頭蚴 plerocercoid larvae
裂頭絛蟲的幼蟲，是假葉目（Pseudophyllidea）、裂頭科（Diphyllobothriidae）絛蟲第三期幼蟲的總稱（參見附錄A）。
3.2
闊節裂頭蚴 plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus或phyllobothrium latum
3.3
曼氏裂頭蚴 plerocercoid larvae of Spirometra mansoni
6.4 4 儀器器材
4.1 生物顯微鏡。
4.2 體視顯微鏡。
4.3 PCR擴增儀。
4.4 電泳儀。
4.6 超淨工作臺。
4.7 高速離心機。
4.8 解剖用手術器械。
6.5 5 試劑材料
6.5.1 5.1 試劑
胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸電泳緩衝液（TAE）；瓊脂糖凝膠；6×加樣緩衝液；100～2000 bp DNA marker；滅菌雙蒸餾水（ddH2O）；70%乙醇（配製見附錄B的B.1）。
6.5.2 5.2 引物
擴增裂頭蚴核糖體DNA轉錄間隔區（ITS）引物序列；擴增裂頭蚴細胞色素C氧化酶（Coxl）引物序列；闊節裂頭蚴特異性引物序列及曼氏裂頭蚴特異性引物序列（見附錄B的B.2）。
6.5.3 5.3 陽性對照
陽性對照爲裂頭絛蟲相應基因片段的陽性克隆質粒或裂頭蚴、裂頭絛蟲全基因組DNA。
6.6 6 檢測步驟
6.6.1 6.1 樣品準備
6.1.1 樣品種類：海魚、淡水魚、蛙和蛇。
6.6.2 6.2 樣品檢測
6.6.2.1 6.2.1 壓片檢查法
用手術剪對受檢的魚、蛙和蛇逐條／只進行解剖。取出內臟，將腹腔壁內膜刮下，觀察腹腔內壁表面，若有可疑白色點狀物，用手術剪或手術刀分離皮肉，用兩把小鑷子將肌肉撕開，取含有白色點狀物的組織用載玻片壓片，用生物顯微鏡鏡檢判定結果。
6.6.2.2 6.2.2 蛋白酶消化法
稱取樣品250 g並剪成小塊，按樣品與胃蛋白酶消化液1：5的比例加入消化液，37℃消化至無肉眼可見的肉組織爲止。消化後用0.8mm×0.8mm（10目）網篩過濾，濾液置於尖底量筒內，加水（用水參照GB/T 66828）至最大刻度處，沉澱洗滌至水清，全部沉渣置平皿，用體視顯微鏡鏡檢判定結果。
6.6.2.3 6.2.3 核酸檢測法
6.6.2.3.1 6.2.3.1 取樣
在體視顯微鏡下挑取蟲體，初步鑑定後備用。PCR反應設立陽性對照，對照爲裂頭絛蟲相應基因片段的陽性克隆質粒或裂頭蚴、裂頭絛蟲全基因組DNA。無菌水作空白對照。
6.6.2.3.2 6.2.3.2 DNA的提取
（見附錄B的B.3）
6.6.2.3.3 6.2.3.3 反應體系
總體積爲25μL，模板DNA 2μL，上下游引物（10Lmol/L）各0.5μL，dNTPs 2μL，MgCl22.5μL，10xBuffer 2.5μL，Taq酶（5 U/μL） 0.2μL，補充ddH2O至25μL。
6.6.2.3.4 6.2.3.4 PCR反應程序
94℃預變性3 min; 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸7 min。
6.6.2.3.5 6.2.3.5 電泳
取10μL產物與2μL的6×加樣緩衝液混合，加樣於含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中。在1×TAE緩衝液中，3 V/cm～4 V/cm電泳約30 min，當溴酚藍到達底部時停止電泳，用凝膠成像系統分析。
6.6.3 6.3 結果判定
6.6.3.1 6.3.1 裂頭屬的裂頭蚴判定
若從魚體內檢出的幼蟲大小若長2mm～20 mm，寬2mm～3 mm，乳白色，頭節呈匙形，其背腹面各有一條窄而深凹的吸槽，體前端有凹陷且稍大，體不分節但具有橫皺褶，尾部細，呈棍棒狀，具有與成蟲相似的頭節，可初步判定裂頭屬的裂頭蚴（參見附錄C）。
6.6.3.2 6.3.2 迭宮屬的裂頭蚴形態判定
若從蛙或蛇體內檢出的幼蟲大小若長0.5cm～80 cm，寬0.3cm～1 cm，長帶形，乳白色或淡黃色，蟲體前端無吸槽，頂端中央有一孔向內凹陷成隧道狀，並向後延伸形成盲管，蟲體不分節，具有不規則的皺褶，可初步判定爲迭宮屬的裂頭蚴（參見附錄C）。
6.6.3.3 6.3.3 核酸擴增結果判定
6.3.3.1 目的基因擴增片段出現條帶而空白對照未出現條帶，實驗結果成立。
6.3.3.2 闊節裂頭蚴特異引物擴增，出現428 bp的特徵條帶，初步判定該蟲種爲闊節裂頭蚴。
7 附錄
7.1 附錄A（資料性附錄）病原學資料
裂頭蚴（plerocercoid）是假葉目（Pseudophyllidea）、裂頭科（Diphyllobothriidae）絛蟲的第三期幼蟲的總稱。裂頭科中的裂頭屬（Dibothriocephalus）又名雙葉槽屬（Diphyllobothrium）及迭宮屬（Spirometra）的裂頭蚴可感染人體。
7.1.1 A.1 形態
7.1.1.1 A.1.1 裂頭屬的裂頭蚴的形態
闊節裂頭蚴長2 mm～20 mm，寬2mm～3 mm，乳白色，頭節呈匙形，其背腹面各有一條窄而深凹的吸槽，體前端有凹陷且稍大，體不分節但具有橫皺褶，尾部細，呈棍棒狀，具有與成蟲相似的頭節，裂頭蚴皮層表面覆蓋微毛，長度約1.5μm。
7.1.1.2 A.1.2 迭宮屬的裂頭蚴形態
曼氏裂頭蚴長0.5cm～80 cm，寬0.3cm～1 cm，長帶形，乳白色或淡黃色，蟲體前端無吸槽，頂端中央有一孔向內凹陷成隧道狀，並向後延伸形成盲管，蟲體不分節，具有不規則的皺褶。
7.1.2 A.2 生活史
闊節裂頭絛蟲成蟲寄生在人以及犬、貓、豬等動物的小腸內。蟲卵隨宿主糞便排出後，在15～25℃的水中，經過7d～15d的發育，孵出鉤球蚴。當鉤球蚴被劍水蚤吞食後，在其血腔內經過2周～3周的發育成原尾蚴。當受感染的劍水蚤被小魚或幼魚吞食後，原尾蚴可在魚的肌肉、性腺、卵內發育爲裂頭蚴，裂頭蚴並可隨着魚卵排出。當大魚吞食含有裂頭蚴的小魚或魚卵後，裂頭蚴可侵入大魚的肌肉組織內繼續生存，直到終宿主食入帶裂頭蚴的魚時，裂頭蚴方能在其腸內經5周～6周發育爲成蟲。成蟲在終宿主體內可活5年～13年。可感染闊節裂頭蚴的第二中間宿主有：白斑狗魚（Esox lucius）、江鱈（Lota lota）、河鱸（Perca fluviatilis）、三刺魚（Gasterosteus aculeatus）、櫻花鉤吻鮭（Oncorhynchus masou）、鮻魚（Liza haematocheila）、溪紅點鮭（Salvelinus fontinalis）、虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）、雅羅魚屬鯉（Leuciscus rutilus）、八目鰻（Lampetra japonicum）等。
曼氏迭宮絛蟲的成蟲寄生在貓、犬及食肉野生動物爲終宿主的小腸內，蟲卵隨宿主糞便排出體外，在適宜溫度下，經過2周～5周發育孵出六鉤蚴，被劍水蚤吞食後發育成原尾蚴，原尾蚴被蛙類吞食可發育成裂頭蚴，人吞食含有裂頭蚴的第二中間宿主可引起曼氏裂頭蚴病。可感染曼氏裂頭蚴的第二中間宿主爲蛙類；鳥類、蛇類、豬可作爲轉續宿主。
7.2 附錄B（規範性附錄）與檢測相關的技術方法
7.2.1 B.1 試劑配製
胃蛋白酶2g，濃鹽酸0.7 mL，加蒸餾水至100 mL，現用現配。
三羥甲基氨基甲烷（Tris鹼）242 g，冰乙酸57.1 mL，pH 8.0的0.5 mol/L EDTA液100 mL，加蒸餾水定容至1000 mL，製成50xTAE緩衝液，混勻4℃保存備用。臨用前50倍稀釋。
B.1.3 1×TAE使用液
50×TAE 20 mL，加蒸餾水定容至1000 mL，混勻備用。
B.1.4 10 mg/mL溴化乙錠液
溴化乙錠1g，加蒸餾水定容至100 mL，磁力攪拌至完全溶解，室溫避光保存。
瓊脂糖1.5 g，加1xTAE定容至100 mL，完全融化後，溶液冷卻至60℃，加10 mg/mL溴化乙錠5μL（終濃度0.5μg/mL），輕輕混勻後，製備凝膠。
B.1.6 6×加樣緩衝液
溴酚藍0.25 g，蔗糖40 g，加蒸餾水至100 mL。置4℃保存備用。
B.1.7 商品化試劑盒
Taq酶、dNTP等核酸提取及PCR試劑可選用商品化試劑和試劑盒。
7.2.2 B.2 引物模板
相關引物
引物名稱 | 引物編號 | 序列 | 片段大小/bp |
裂頭蚴ITS通用引物 | 18S-DF1 | 5'-ACTTGATCATTTAGAGGAAGT-3' | 1409 |
28S-DR4 | 5'-CTCCGCTTAGTGATATGCT-3' | ||
裂頭蚴Cox1通用引物 | JB6 | 5'-GATAGTAAGGGTGTTGA-3' | 650 |
JB5R | 5 '-CAAGTATCRTGCAAAATATTATCAAG-3' | ||
闊節裂頭蚴特異引物 | Dl/Dn-1805F | 5'-CAGTGGGAATGGTGCTTGTAATGT-3' | 428 |
Dl-2211R | 5'-TAACCTTTACTTATAACTACT-3' | ||
F965 | 5 '-CTTGGCTTTATATGATTTAAATAG-3' | 156 | |
R1120 | 5'-GTTTGGTGCACAGTACGTTTTAAAA-3' |
7.2.3 B.3 DNA的提取
B.3.1 挑取單條待鑑定蟲體放入滅菌離心管，加入滅菌蒸餾水，半小時換一次水，重複洗滌3次，洗滌完畢後棄掉離心管中蒸餾水，用碾磨棒將離心管中蟲體碾碎，加入180μL Buffer ATL，20μL蛋白酶K，混勻後於56℃孵育1～3 h至消化完全，期間不時振盪搖晃。
B.3.2 消化完全後，漩渦震盪15 s，加200μl Buffer AL，立即漩渦振盪混勻，再加入200μl乙醇（96～100%），漩渦振盪混勻。
B.3.3 離心柱置於收集管上，將上一步的混合物吸入離心柱中，8000 r/min離心1 min，棄收集管。
B.3.4 將離心柱置於新的收集管中，加500 μl Buffer AW1，8000 r/min離心1 min，棄收集管。
B.3.5 將離心柱置於新的收集管中，加500 μl Buffer AW2，14000 r/min離心3 min，棄收集管。
B.3.6 將離心柱置於滅菌的1.5 ml離心管中，加入200 μl Buffer AE室溫孵育1 min，8000 r/min離心1min，離心所得DNA於-20℃冰箱保存備用（重複該步驟可擴大DNA回收率）。
7.2.4 B.4 實驗試劑代碼解釋（試劑盒自帶）
7.3 附錄C（資料性附錄）裂頭蚴實物圖
C.3 蛙體內的曼氏裂頭蚴見圖C.3
注：圖C.1來自參考自文獻：Tomàš Scholz, Hector H.Garcia, Roman Kuchta, Barbara Wicht. Update on the Human Broad Tapeworm （Genus Diphyllobothrium）, Including Clinical Relevance. [J] Clin Microbiol Rev.2009 January; 22 （1）:146-160. doi: 10.1128/CMR.00033-08
8 參考文獻
[1] 吳觀陵，人體寄生蟲學，第4版，北京：人民衛生出版社，2013.
[2] Scholz T,Garcia HH, Kuchta R,Wicht B.Update on the human broad tapeworm （genus diphyllobothrium）, including clinical relevance. Clin Microbiol Rev.2009,22（1）:146-160.
[3] 餘森海，許隆祺，人體寄生蟲學彩色圖譜，第1版，北京：中國科學技術出版社，1992.
[4] 劉自逵，劉國華，戴榮四，劉偉，李芬，等，湖南省蝟迭宮絛蟲的線粒體cox1和nad1基因的序列測
定及種系發育分析，畜牧獸醫學報.2010,41: 463-468.
[5] Wicht B,Ruggeri-Bernardi N, Yanagida T,Nakao M, Peduzzi R,et al. Inter-and intra-specific characterization of tapeworms of the genus Diphyllobothrium （Cestoda: Diphyllobothriidea） from Switzerland, using nuclear and mitochondrial DNA targets. Parasitol Int.2010,59:35-39.
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