3 基本信息
ICS 11.020
C 61
中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 564—2017《巴貝蟲病診斷》（Diagnosis of Babesiosis）由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會2017年8月1日《關於發佈〈釘螺調查〉等9項推薦性衛生行業標準的通告》（國衛通〔2017〕11號）發佈，自2018年2月1日起實施。
4 發佈通知
關於發佈《釘螺調查》等9項推薦性衛生行業標準的通告
國衛通〔2017〕11號
現發佈《釘螺調查》等9項推薦性衛生行業標準，其編號和名稱如下：
上述標準自2018年2月1日起施行。
特此通告。
國家衛生計生委
2017年8月1日
5 前言
本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。
本標準起草單位：上海市寄生蟲學會、復旦大學、中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所、中國醫學科學院醫學實驗動物研究所、復旦大學附屬華山醫院、浙江省疾病預防控制中心、中國農業科學院上海獸醫研究所。
本標準主要起草人：陳家旭、程訓佳、許學年、秦川、張文宏、姚立農、周金林、魏強、陳韶紅、鄭彬、陳木新。
6 標準正文
巴貝蟲病診斷
6.1 1 範圍
本標準適用於各級醫療機構和疾病預防控制機構對巴貝蟲病的診斷。
6.2 2 術語和定義
下列術語和定義適用於本文件。
2.1
巴貝蟲 Babesia. spp
寄生在人和脊椎動物紅細胞內的原蟲，感染人的主要有田鼠巴貝蟲（Babesia microti）、分歧巴貝蟲（B.divergens）、鄧肯巴貝蟲（B.duncani）、獵戶巴貝蟲（B.venatorum）等（參見附錄A）。
2.2
巴貝蟲病 babesiosis/babesiasis
2.3
2.4
重症巴貝蟲病 severe babesiosis
巴貝蟲病確診病例，出現高熱、重度貧血、黃疸、血紅蛋白尿、呼吸窘迫、腎功能衰竭、昏迷等一項或多項臨牀表現。
6.3 3 診斷依據
6.3.1 3.1 流行病學史
6.3.2 3.2 臨牀表現
3.2.1 常見臨牀表現：寒戰、發熱、出汗、乏力、噁心、食慾減退、肌肉疼痛、關節疼痛、頭痛、腹痛、貧血等（參見附錄C的C．1）。
3.2.2 重症臨牀表現：高熱、重度貧血、血紅蛋白尿、黃疸、呼吸窘迫、腎功能衰竭、昏迷等（參見附錄C的C．2）。
6.3.3 3.3 實驗室檢查
6.4 4 診斷原則
6.5 5 診斷
6.5.1 5.1 無症狀感染者
無明顯臨牀症狀和體徵，並同時符合3.3.1、3.3.2和3.3.4中任一條。
6.5.2 5.2 疑似病例
符合3.1，並同時符合3.2中任一條。
6.5.3 5.3 臨牀診斷病例
疑似病例並同時符合3.3.3。
6.5.4 5.4 確診病例
臨牀診斷病例或疑似病例，並同時符合3.3.1、3.3.2和3.3.4中任一條。
6.5.5 5.5 重症病例
確診病例，同時符合3.2.2。
6.6 6 鑑別診斷
7 附錄
7.1 附錄A（資料性附錄）病原學
7.1.1 A．1 分類
巴貝蟲屬於頂復門（Apicomplexa）、孢子蟲綱（Sporozoa）、梨形蟲亞綱（Prioplasmasina）、梨形蟲目（Piroplasmida）、巴貝蟲科（Babesiidae）、巴貝蟲屬（Babesia）。目前己鑑定的有100多種巴貝蟲，可以感染牛、馬、羊、犬等多種哺乳動物和鳥類。能感染人體的巴貝蟲主要有田鼠巴貝蟲（Babesia microti）、分歧巴貝蟲（B.divergens）、鄧肯巴貝蟲（B.duncani）、獵戶巴貝蟲（B.venatorum）等。
7.1.2 A．2 形態
巴貝蟲在紅細胞內形態多樣。常見蟲體形態有環形、圓形、杆形、點狀、梨形、阿米巴形等。典型形態爲梨形，常在一個紅細胞內有多個蟲體寄生，以1～4個蟲體居多，可形成三聯體，或四聯體型，即馬耳他十字形；且可爲不同發育時期的蟲體。經瑞氏或吉氏染色後，胞漿呈藍色，核呈紅色。根據蟲體大小分爲：大型巴貝蟲，體長2.5μm～5μm，如分歧巴貝蟲；小型巴貝蟲，體長1.0μm～2.5μm，如田鼠巴貝蟲。
7.1.3 A．3 生活史
巴貝蟲的生活史主要包括在人或脊椎動物紅細胞內的發育階段和媒介蜱體內發育階段。巴貝蟲的子孢子通過蜱叮咬隨唾液進入人或脊椎動物體內，侵入紅細胞後，通過出芽生殖方式或二分裂增殖發育成裂殖子。隨着紅細胞破裂，裂殖子釋放後，再侵入新的紅細胞，重複分裂增殖。部分蟲體不再進行裂體增殖，而發育成雌雄配子體。配子體通過蜱吸食宿主血液進入蜱體內，在腸道中發育爲配子，進而結合成合子，然後進行增殖，再通過血淋巴移行至蜱體內各個組織。移行到蜱唾液腺的合子，進一步發育爲子孢子，完成一個生活週期。巴貝蟲在蜱間傳播方式有：①經卵傳遞：雌蜱吸血後，巴貝蟲在蜱體內繁殖發育後，進入蜱卵巢，經卵傳遞給下一代蜱。②期間傳播：幼蜱（或若蜱）吸食含有巴貝蟲的血液後發育，將蟲體傳給下一個發育階段。
7.2 附錄B（資料性附錄）流行病學
7.2.1 B．1 傳染源
感染巴貝蟲的人和社鼠、褐家鼠、黃胸鼠、黑線姬鼠等齧齒類，及牛、鹿、犬、浣熊、鳥類等動物。
7.2.2 B．2 傳播途徑
7.2.3 B．3 易感人羣
人對巴貝蟲普遍易感。
7.2.4 B．4 地區分佈
7.2.4.1 B．4.1 國外分佈
巴貝蟲呈世界性分佈，自1888年羅馬尼亞科學家Babes首次從病牛紅細胞中發現雙芽巴貝蟲（Babesia bigemina）以來，己鑑定報道100餘種，但感染人體的主要有田鼠巴貝蟲、分歧巴貝蟲、鄧肯巴貝蟲和獵戶巴貝蟲等數種。1957年南斯拉夫學者報道了首例人體巴貝蟲感染病例之後，美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲等均有巴貝蟲感染病例報道，以美洲、歐洲地區爲多。美國自2011年將巴貝蟲病作爲法定傳染病報告以來，每年報告約1000例感染者，主要流行蟲種爲田鼠巴貝蟲。而歐洲地區報道病例略少，主要流行蟲種爲分歧巴貝蟲、獵戶巴貝蟲和田鼠巴貝蟲。近年來，埃及、墨西哥、南非、莫桑比克、澳大利亞、巴西、日本、韓國等相繼報道了人感染巴貝蟲的病例。
7.2.4.2 B．4.2 我國分佈
我國首次人體巴貝蟲感染病例報告可追溯到1944年，洪式閭對重慶地區一例疑似瘧原蟲感染者的血塗片檢查時，根據原蟲形態特徵分析判定，該患者爲巴貝蟲感染。至今，我國己報告病例約100例，病例報告地區包括黑龍江、雲南、重慶、廣西、上海、新疆、浙江、內蒙古、山東及臺灣等，報道病例較多的地區爲黑龍江和雲南。我國分佈蟲種主要是田鼠巴貝蟲、獵戶巴貝蟲和分歧巴貝蟲，南方以田鼠巴貝蟲爲主，北方則以獵戶巴貝蟲爲主。多數病例發病集中在夏季，可能由於該季節是蜱蟲活動的高峯期，易引起人的感染。在我國文獻報道病例中少數患者有明確的蜱蟲叮咬史、手術輸血史，有些患者無明確的感染方式。
7.3 附錄C（資料性附錄）臨牀表現
7.3.1 C．1 常見臨牀表現
巴貝蟲病的臨牀表現與無性繁殖期巴貝蟲破壞紅細胞程度及宿主免疫狀態有關，其潛伏期1周～4周。免疫功能正常者多呈自限性，症狀可持續2周～4周。症狀包括寒戰、發熱、出汗、乏力、噁心、食慾減退、肌肉疼痛、關節疼痛、頭痛、腹痛、貧血或血紅蛋白尿等。
7.3.2 C．2 重症臨牀表現
重症患者起病急，多發生於脾切除、老年體弱及免疫功能低下患者。病人可出現高熱（體溫可達40℃）、重度貧血、血紅蛋白尿、呈醬油色尿、黃疸、呼吸窘迫、腎功能衰竭或昏迷，甚至死亡。病人肝功能異常。
7.4 附錄D（規範性附錄）實驗室檢查
7.4.1 D．1 血塗片鏡檢
7.4.1.1 D．1.1 血塗片的製作
用一次性採血針在耳垂或指端採血，嬰兒可從拇趾或足跟採血。取血在表面潔淨、無刮痕的載玻片上塗制薄血膜。用推片中部刮取血液1.0μL～1.5μL，將推片下緣平抵載玻片的中線，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2 cm寬時，使兩張玻片保持25°～35°角，迅速推成舌狀薄血膜。
7.4.1.2 D．1.2 染色
7.4.1.2.1 D．1.2.1 吉氏染色
染色前先用甲醇固定血膜。成批染色時，將血膜朝一個方向插入染色缸中，或每對載玻片血膜朝外插入染色缸中，倒入新配製的2%吉氏染液（2 mL吉氏原液與98 mL蒸餾水或PBS緩衝液混勻）浸沒薄血膜，30 min後，向染色缸中注入自來水或PBS緩衝液至溢出，除掉染液表面浮渣，將染色缸中殘餘的染液傾出，加入新水，反覆沖洗2～3次，然後取出玻片，將血膜朝下插在晾片板上晾乾。單張血膜染色可取PBS緩衝液2 mL加入吉氏染液1～2滴，混勻後滴在薄血膜上，20 min～30 min後，水洗、晾乾。
7.4.1.2.2 D．1.2.2 瑞氏染色
在薄血膜上加瑞氏染液5～8滴，固定染色1 min～2 min。然後再加5～8滴蒸餾水於血膜上，用吸管將染液與蒸餾水混合均勻，染色3 min～5 min後，用清水輕輕衝去染液，晾乾。
7.4.1.3 D．1.3 血塗片檢查
染色後的血膜用光學顯微鏡檢查。經瑞氏或吉氏染色後，巴貝蟲胞漿呈藍色，核呈紅色。常見蟲體形態有環形、圓形、杆形、點狀、梨形、阿米巴形、馬耳他十字等。檢查到上述形態的巴貝蟲爲陽性。
7.4.2 D．2 巴貝蟲核酸檢測
7.4.2.1 D．2.1 樣本處理
採取核酸提取試劑盒或其他基因組DNA提取方法提取巴貝蟲DNA。
7.4.2.2 D．2.2 試劑組成
7.4.2.3 D．2.3 操作步驟和結果判讀
7.4.2.3.1 D．2.3.1 引物序列
採用巢氏PCR方法從患者紅細胞中檢測巴貝蟲18S rRNA特異性基因。引物序列如下：
引物名稱 | 引物序列 |
Bab 5（第一輪上游引物） | 5'-AATTACCCAATCCTGACACAGG-3' |
Bab 8（第一輪下游引物） | 5'_TTTCGCAGTAGTTCGTCTTTAACA-3' |
Bab 6（第二輪上游引物） | 5'-GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA-3' |
Bab 7（第二輪下游引物） | 5'-CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC-3' |
7.4.2.3.2 D．2.3.2 第一輪擴增
以引物Bab5和Bab8進行第一輪擴增，反應體系爲50μL:
Taq酶 5 U/μL 0.25μL
10×buffer 5μL
dNTP 4μL
Bab520μmol/L 1.5μL
Bab820μmol/L 1.5μL
DNA模板 2μL
ddH2O 35.75μL
PCR過程爲：
95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1min共35個循環；72℃ 7 min。
7.4.2.3.3 D．2.3.3 第二輪擴增
取PCR產物2μL，以Bab6和Bab7進行第二輪擴增，反應體系爲50 μL:
Taq酶 5 U/μL 0.25μL
10×buffer 5μL
dNTP 4μL
Bab620μmol/L 1.5μL
Bab720μmol/L 1.5μL
PCR產物 2μL
ddH2O 35.75μL
PCR過程爲：
95℃ 5 min; 95℃ 45s，55℃ 45 s，72℃ 1min共35個循環；72℃ 7 min。
將第二輪的PCR產物進行電泳，確認片段大小約爲400 bp的特異片段。PCR產物經割膠回收後，連入載體，進行克隆並測序分析，確定巴貝蟲感染。
7.4.3 D．3 巴貝蟲抗體檢測
7.4.3.1 D．3.1 方法
採用間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，檢測人血清、血漿或其他體液樣品中的巴貝蟲IgG（或IgM）抗體。
7.4.3.2 D．3.2 試劑組成
巴貝蟲診斷抗原（5μg/mL～10μg/mL）包被的96微孔板、葡萄球菌蛋白A（SPA）或抗人IgG（或IgM）酶標結合物、洗滌液（含有0.050/ Tween-20的PBS緩衝液）、稀釋液（含有1%牛血清白蛋白的洗滌液）、終止液（主要成分爲2 mol/L硫酸溶液）、底物A液（主要成分爲過氧化氫）、底物B液（主要成分爲四甲基聯苯胺）、陽性對照和陰性對照。
7.4.3.3 D．3.3 操作步驟
在盛有0.5 mL稀釋液的1.5 mL塑料離心管或稀釋板孔中，加入5μL待檢測樣混勻。在包被巴貝蟲抗原的96微孔板中加入稀釋的待檢樣品100μL（復孔檢測），設陽性對照2孔，陰性對照2孔，並設空白對照2孔，置37℃孵育30 min。隨後棄去孔內液體，用洗滌液洗滌3次，每次間隔1 min，甩幹。除空白對照孔外，每孔加入酶標結合物50μL，37℃孵育30 min。棄去孔內液體，用洗滌液洗滌3次，每次間隔1 mm，甩幹。每孔依次加入底物A液、底物B液各50μL，輕叩微孔板混勻，37℃避光放置5 min～10 min。每孔加入終止液50μL。
7.4.3.4 D．3.4 結果判讀
用酶標檢測儀在450 nm波長下，空白孔調零，測定各試驗孔OD值。如S/N（樣品孔OD值／陰性對照孔OD均值）≥2.1，結果判爲陽性。
7.4.4 D．4 動物接種
取患者外周抗凝血，無菌接種於BALB/c小鼠、SCID小鼠、NOD-SCID小鼠或地鼠，每隻腹腔接種0.5 mL。自接種一週後開始尾部採血，製備血塗片並染色，鏡檢觀察紅細胞染蟲狀況（參見D.1）。查見巴貝蟲則判爲病原學陽性。
7.5 附錄E（資料性附錄）鑑別診斷
7.5.1 E．1 瘧疾
到過瘧疾流行區旅遊或工作，有蚊蟲叮咬史。典型的瘧疾發作先後出現寒戰、發熱、出汗、退熱的週期性症狀，瘧原蟲鏡檢陽性或瘧疾快速診斷試劑檢測陽性。血片染色後鏡檢巴貝蟲與瘧原蟲的區別：間日瘧原蟲感染紅細胞明顯大於正常紅細胞，巴貝蟲感染紅細胞大小無明顯改變；惡性瘧原蟲感染紅細胞大小無改變，常見環狀體，而巴貝蟲形態多樣；同時注意與三日瘧和卵形瘧原蟲的鑑別診斷。
7.5.2 E．2 萊姆病
萊姆病也是一種以蜱爲媒介傳播的感染性疾病，是由伯氏疏螺旋體所致的自然疫源性疾病。患者常出現遊走性紅斑、乏力、畏寒發熱、頭痛、噁心、嘔吐、關節疼痛或肌肉疼痛等症狀。
7.5.3 E．3 恙蟲病
有恙蟎叮咬史。患者在陰部或細嫩的皮膚上有焦痂或黃豆大的潰瘍，全身淺表淋巴結腫大，數月消失，病後4 d～6 d胸腹部有紅色斑丘疹。其熱型爲稽留或馳張型。外斐試驗陽性。
7.5.4 E．4 黑熱病
有到過黑熱病流行區，有白蛉叮咬史。一般有不規則發熱、肝脾腫大、淋巴結腫大、貧血等症狀。骨髓塗片可查見利什曼原蟲。
7.5.5 E．5 登革熱
有到過登革熱流行區，有蚊蟲叮咬史。起病急驟，臨牀表現複雜多樣，有高熱、頭痛、眼球痛、肌肉與關節疼痛、鼻衄、淋巴結腫大、出疹等症狀，一般在發熱4 d～5 d時出現斑疹，分佈於軀幹、面部和四肢，隨體溫下降皮疹消失。血清登革熱病毒特異性IgM抗體陽性。恢復期血清IgG抗體比急性期高4倍以上。
7.5.6 E．6 敗血症
有寒戰、高熱、出汗等症狀，熱型多爲弛張熱，無週期性，白細胞總數升高伴中性粒細胞增多，血培養可見致病菌，有原發病竈和皮膚膿腫以及擠壓癤瘡等病史。
8 參考文獻
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