WS/T 461—2015 糖化血紅蛋白檢測

1 拼音

WS/T 461—2015 táng huà xuè hóng dàn bái jiǎn cè

2 英文參考

Measurement of Hemoglobin A1c

ICS 11.100

C 50

中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 461—2015《糖化血紅蛋白檢測》（Measurement of Hemoglobin A_1c）由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會於2015年06月23日發佈，自2015年12月31日起實施。

3 前言

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。

本標準起草單位：北京醫院、北京市醫療器械檢驗所、北京大學人民醫院。

本標準主要起草人：王冬環、陳文祥、張傳寶、馬嶸、孫京昇、續勇、賀學英、畢春雷、紀立農。

糖化血紅蛋白檢測

4 1 範圍

本標準規定了糖化血紅蛋白的檢測和質量保證。

本標準適用於臨牀實驗室及從事流行病學研究的實驗室開展糖化血紅蛋白的檢測，試劑或儀器生產廠商可參照使用。

5 2 術語和定義

下列術語和定義適用於本文件。

2.1

分析系統 analytical system

適合對某檢驗項目在規定濃度範圍內給出分析結果的一組按規定條件使用的儀器和裝置，包括試劑和物品。

注：對於臨牀檢驗，分析系統主要由按規定條件使用的儀器、試劑和校準物組成。

2.2

驗證 verification

爲給定項目滿足規定要求提供客觀證據。

注：本文件中的驗證主要是指分析系統的驗證，即某分析系統在本實驗室的性能是否與規定性能指標或廠商提供的性能指標一致。

2.3

糖化血紅蛋白 Hemoglobin A_1c；HbA_1c

人體血液中葡萄糖與血紅蛋白β鏈N末端纈氨酸殘基以共價鍵結合的穩定的化合物，全稱爲：血紅蛋白β鏈（血液）-N-（1脫氧果糖1基）血紅蛋白β鏈。

注：爲避免混淆，國際專家組織建議，糖化血紅蛋H的術語應爲HbA_1c，在指南或教育資料中可以使用縮寫A_1C描述糖化血紅蛋白。

6 3 分析方法概述

HbA_1c是糖化血紅蛋白的主要組成成分，佔總糖化血紅蛋白（glycated Hemoglobin，GHb）的60%，目前臨牀定量測定及應用的是HbA_1c結果。HbA_1c由葡萄糖的遊離醛基與HbA的β鏈N末端纈氨酸的氨基經非酶促結合反應，先形成不穩定的Schiff鹼（醛亞胺），然後經過Amadori（葡糖胺）重排，最後形成穩定的酮胺化合物，其含量主要取決於血糖濃度及血糖與血紅蛋白的接觸時間，可以反映測定前120 d的平均血糖水平，糖化血紅蛋白的個體內生物學變異小於2%。

目前臨牀實驗室普遍採用的糖化血紅蛋白測定方法有多種，按原理可分爲兩大類：一類是基於糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷不同，如離子交換層析法、電泳法；另一類是基於糖化與非糖化血紅蛋白的結構不同，如免疫法、親和層析法及酶法等。不同方法採用的原理不同，所測組分不同，如：離子交換色譜法測定HbA_1c，親和層析法測定總糖化血紅蛋白等，但由於國際臨牀化學與醫學實驗室聯盟（IFCC）及美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃（NGSP）的標準化工作，糖化血紅蛋白的測定方法均應以“HbA_1c”或相當於“HbA_1c”報告結果。

7 4 干擾因素

7.1 4.1 概述

糖化血紅蛋白是紅細胞中血紅蛋白與葡萄糖的結合產物，因此，任何引起血紅蛋白數量與質量變化的因素都會干擾HbA_1c測定，對結果產生影響。干擾因素包括：血紅蛋白病、衍生血紅蛋白、紅細胞生存週期的異常及藥物等。有些干擾因素及干擾程度取決於所採用的測定方法（方法學特異），而有些干擾無論採用何種方法都無法克服（非方法學特異）。

實驗室應知曉HbA_1c測定存在的干擾因素，某些患者人羣可能需要用某種特異的HbA_1c測定方法或不適宜採用HbA_1c來反映體內平均血糖水平。

7.2 4.2 非方法學特異的干擾因素

7.2.1 4.2.1 紅細胞生存週期的異常

4.2.1.1 任何可能縮短紅細胞壽命的因素如：溶血性貧血、大量失血、脾腫大、風溼性關節炎、慢性肝臟

疾病等均可使HbA_1c的測定結果假性降低。

4.2.1.2 任何可以引起紅細胞平均壽命增加的因素如：脾切除、再生障礙性貧血、缺乏維生素B₁₂、腎損傷等均可使HbA_1c的測定結果假性升高。

7.2.2 4.2.2 血紅蛋白病

目前許多測定方法可以在一定程度上克服大部分常見的變異血紅蛋白的干擾，但仍有特殊的變異血紅蛋白干擾測定結果。

7.2.3 4.2.3 藥物

4.2.3.1 維生素C和維生素E可以抑制血紅蛋白的糖基化，長期大劑量服用可以使HbA_1c測定結果假性降低。

4.2.3.2 長期大劑量服用乙酰水楊酸鹽、嗜酒會導致血紅蛋白乙酰化，使HbA_1c測定結果假性升高。

4.2.3.3 長期使用慢性麻醉劑、羥基脲，可以使HbA_1c測定結果假性升高。

7.2.4 4.2.4 妊娠

妊娠時血容量增加，使HbA_1c測定結果假性降低。

7.2.5 4.2.5 進展迅速的1型糖尿病

HbA_1c、不能真實反映急性血糖變化情況，測定結果假性降低。

7.2.6 4.2.6 黃疸、高脂血症

嚴重的黃疸、高脂血症可能干擾測定結果，使測定結果假性升高。

7.3 4.3 方法學特異的干擾因素

7.3.1 4.3.1 總述

通常情況下，變異血紅蛋白及衍生血紅蛋白主要干擾基於糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷不同的

離子交換色譜法，包括離子交換高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。

某些測定方法在參考區間內不受變異血紅蛋白及衍生血紅蛋白的干擾，但隨着糖化血紅蛋白值的增高，干擾也會增加，需仔細觀察測定結果圖譜。

7.3.2 4.3.2 血紅蛋白病

變異血紅蛋白HbS、HbC、HbD和HbE等可使測定結果假性降低或升高，主要取決於變異血紅蛋白的種類和所採用的測定方法。

7.3.3 4.3.3 衍生血紅蛋白

腎病患者可使血紅蛋白甲酰化，使測定結果假性升高。

7.3.4 4.3.4 醛亞胺（Schiff鹼）的干擾

Schiff鹼是HbA_1c形成過程的中間體，也稱“HbA_1c前體”或“不穩定的HbA_1c”，主要干擾基於糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷不同原理的離子交換色譜法，可參照廠家操作說明白動或手工去除Schiff鹼的干擾。

目前許多全自動的測定方法已經在很大程度上消除了Schiff鹼的干擾，但個別樣品的干擾依然存在，會使測定結果假性升高，離子交換HPLC法亦包括在內，因此，應仔細觀察測定結果圖譜。

8 5 樣品採集、處理和儲存

8.1 5.1 樣品採集

5.1.1 檢測樣品不受飲食和採血時間的影響。

5.1.2 按照適用於臨牀實驗室檢測的常規方法採集靜脈血，也可採集手指末端毛細血管血。

5.1.3 採用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的採血管，或根據廠家要求使用採血管。

8.2 5.2 樣品處理和儲存

5.2.1 不同測定方法的樣品穩定性是不同的。

5.2.2 一般情況下，全血樣品在4℃儲存，可以穩定1周。

5.2.3 在-70℃或更低溫度可以長期儲存，至少穩定1年以上，但不宜在-20℃長期儲存。

5.2.4 任何對樣品的不當處理，如置於高溫環境，均可引人大量未知干擾，干擾程度取決於所用方法。

9 6 分析系統

9.1 6.1 分析系統選擇

6.1.1 應選用測定結果可溯源至1FCC參考方法（參見附錄A）的分析系統，包括儀器、試劑及校準物，例如：獲得NGSP認證。可選用專用糖化血紅蛋白分析儀，或全白動生化、免疫分析儀。

6.1.2 NGSP認證的分析系統（方法）有效期爲1年。

注：查詢網址：www.ngsp.org/docs/methods.pdf。

6.1.3 不同分析系統干擾因素是不同的，實驗室應知曉所選分析系統可能存在的干擾因素。

注1：常見的變異及衍生血紅蛋白對HbA_1c測定的影響參見www.ngsp.org/factors.asp。

注2：多數POC（point-of-care）方法的精準性不能滿足臨牀需求，日前不能用於糖尿病的診斷。

9.2 6.2 分析系統性能指標

9.2.1 6.2.1 報告結果

以“HbA_1c”或相當於“HbA_1c”報告結果。

9.2.2 6.2.2 精密度

室內變異係數（CV）小於3%，以小於2%爲宜。

注1：目前許多測定方法的室內CV小於2%。

注2：只有控制室內cv小於2%，才能實現室間CV小於3.5%。

注3：HbA_1c測定質量目標：小於0.5% HbA_1c。

9.2.3 6.2.3 精密度實驗方法

分別採用不少於兩個水平的質控物或樣品（高、低值），每天測定兩次（兩次時間間隔不少於兩小時），每次重複測兩個結果，測定20個工作日，以20個工作日的80個結果計算平均值、標準差及變異係數。

9.2.4 6.2.4 正確度

與可接受參考值的差值在±0.5% HbA_1c範圍內，以控制在±0.3% HbA_1c範圍內爲宜。

正確度驗證方法，包括但不限於以下方式：

——參加室間質量評價（能力驗證）計劃；

——採用適當的有證標準物質；

——與運行經過認證分析系統的有資質實驗室的測定結果進行比對。

只有無法得到驗證實驗方法的其他替代材料或過程時，才宜使用廠商產品校準物或正確度控制物。

9.3 6.3 分析系統使用

6.3.1 實驗室在準備使用一個新的分析系統（或新儀器、新試劑）測定臨牀樣品前，應對系統性能進行驗證。

6.3.2 使用經過認證的分析系統，如廠商給出的性能指標不符合6.2要求時，應對系統性能進行驗證；符合6.2要求時，只驗證正確度即可。

6.3.3 使用未經認證的封閉系統或開放系統[備註]1） 試劑和校準物來自同一廠商，儀器另選。，應對分析系統性能進行充分驗證，性能指標除6.2要求外，還應包括干擾因素、測量範圍等。

6.3.4 不宜使用組合系統[備註]2） 試劑、校準物和儀器分別來自不同廠商，由實驗室自己組合。。

9.4 6.4 校準物和質控物

6.4.1 校準物在所選用的儀器、試劑條件下使樣品測定結果能溯源至IFCC參考方法。可使用凍幹或冰凍校準物，校準物復溶或融化後應平衡至室溫並充分混勻後再使用，不可反覆凍融。

6.4.2 質控物應有良好的長期穩定性，至少兩個不同水平（高、低值）。

6.4.3 可選用凍幹或冰凍全血質控物，質控物復溶或融化後應平衡至室溫並充分混勻後再進行測定，不可反覆凍融。

6.4.4 凍乾粉質控物在更換試劑或色譜柱時可能會有基質效應，程度取決於所用方法。

6.4.5 自制新鮮冰凍全血質控物是HbA_1c測定的良好質控物，如自制質控物應認真選擇原料和工藝，原料應爲足夠量的混合新鮮全血，採用凍存管分裝，並對均勻性進行考察評價（參見附錄B），儲存於-70℃或更低溫度，可以穩定1年以上。

9.5 6.5 色譜（層析）柱（適用於使用色譜柱的方法）

實驗室應知曉本室所用色譜柱可檢測樣品的數量，達到檢測數量限應及時更換，不可超量使用。

注：不同方法的色譜柱可檢測樣品數量不同。

10 7 測定

10.1 7.1 安全措施

血液樣品及來源於血液的校準物、質控物有可能含有致病微生物，應避免入口或與皮膚接觸，在使用後應按國家規定的具有危害性的生物品處理。

10.2 7.2 測定程序

7.2.1 實驗室應制定標準操作程序，至少包括以下內容：

——項目名稱；

——方法學原理；

——樣本（採血管／抗凝劑、儲存）；

——校準程序（校準日期間隔、校準方、校準方法）；

——室內質量控制程序（參見附錄C）；

——樣品的測定程序；

——干擾因素；

——參考區間（範圍）；

——試劑；

——色譜柱（可測定樣品數量，適用於使用色譜柱的方法）；

——維護程序。

7.2.2 所用試劑、耗材應按規定存放，在有效期內使用。

7.2.3 所用色譜柱達到檢測數量限應及時更換（適用時）。

7.2.4 所用儀器應定期維護、保養。

10.3 7.3 室內質量控制

7.3.1 應進行室內質控物的測定，室內質控是測定結果是否足夠可靠、報告能否發出的判定依據。在每個測定日的開始和結束都應做質控物分析，並同時測定至少兩個不同水平（高、低值）的質控物。

7.3.2 在同1個工作日內，每出現下列情況之一時，應重新測定質控物：

——質控值超出控制限；

——更換新的試劑；

——進行新的校準；

——更換新的色譜柱（適用時）；

——按規定進行儀器特別保養後。

7.3.3 質控物測定值應在控制限以內，否則應分析、查找失控原因，直到查明原因並糾正失控，纔可發出結果報告。質量控制限的設定及失控判定規則參見附錄C。

10.4 7.4 異常結果的處理

7.4.1 對於測定結果低於參考區間下限或高於15%HbA_1c（140 mmoL/moL）的樣品應進行復查，並與臨牀醫生溝通。

7.4.2 對測定結果與臨牀表現不符的樣品應進行進一步檢測。

11 8 結果報告

11.1 8.1 單位

8.1.1 以NGSP的傳統單位%HbA_1c報告糖化血紅蛋白測定結果，並同時報告IFCC的國際單位制單位（mmol/mol）結果。

8.1.2 NGSP的傳統單位與IFCC的國際單位制單位換算的迴歸方程爲：HbA_1c（NGSP）=0.0915× HbA_1c（IFCC）+2.15%（適用範圍爲：4%HbA_1c～12%HbA_1c）。

8.1.3 以%HbA_1c爲單位的結果小數點後保留1位小數。

8.1.4 如臨牀需要，應提供方法學名稱。

11.2 8.2 參考區間

HbA_1c源於DCCT/UKPDS[備註]3） Diabetes control and complications trial/UK Prospective Diabetes Study，糖尿病控制與併發症試驗／英國前瞻性糖尿病研究。的參考區間爲4% HbA_1c～6% HbA_1c（20mmol/mol～42mmol/ mol），實驗室應對此參考區間進行驗證，如不適用，應建立適用於白己實驗室的參考範圍，並在報告中注明。

12 9 測定質量的監測和保證

9.1 應參加室間質量評價（能力驗證，PT）計劃，室間質量評價計劃是目前驗證實驗室測定結果可靠性、可比性並提高測定質量的有效手段。

9.2 室間質量評價樣品應與臨牀樣品同樣對待。

9.3 實驗室應從以下四個環節保證測定結果質量：

——選用一個可靠的分析系統；

——規範化使用分析系統；

——知曉HbA_1c檢測的干擾因素；

——參加室間質量評價（能力驗證）活動。

13 附錄A（資料性附錄）HbA1c參考系統

13.1 A.1 參考方法

A.1.1 國際臨牀化學與醫學實驗室聯盟（IFCC）

測定HbA_1c國際公認的參考方法爲IFCC推薦的高效液相色譜串聯電噴霧電離一級質譜或高效液相色譜串聯毛細管電泳，兩種方法結果一致。測定方法主要分爲三步：首先製備溶血液；然後採用蛋白內切酶Glu-C將溶血液酶解消化，得到糖基化和非糖基化的β鏈N末端六肽（HbA_1c六肽、HbA₀六肽）；最後採用高效液相色譜串聯電噴霧電離一級質譜或高效液相色譜串聯毛細管電泳對HbA_1c六肽和HbA₀六肽進行定量分析。以標準物質IRMM/IFCC-466 HbA_1c和IRMM/IFCC-467 HbA₀的混合物作爲校準品，同步進行酶解、分析，得到標準曲線，根據HbA_1c、六肽、HbA₀六肽的峯面積比計算得出HbA_1c的量。

A.1.2 HbA_1c測定指定比對方法（Designated Comparison Method，DCM）

美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃（NGSP）使用離子交換高效液相色譜法爲參考方法，目前爲HbA_1c測定的指定比對方法，方法原理主要基於HbA_1c與其他組分所帶的電荷不同，分別洗脫檢出，由於受技術條件的限制，不能特異測定HbA_1c，有其他組分同時檢出，因此，測定結果高於IFCC結果。IFCC參考實驗室及NGSP參考實驗室經過幾年的比對，得出結論：NGSP測定結果與IFCC測定結果之間存在非常確定的相關性，可用迴歸方程表示爲：NGSP-HbA_1c=0.0915×（IFCC-HbA_1c）+2.15%（r²=0.998），因此，現行的NGSP結果可以溯源到IFCC參考系統，即可以溯源到溯源鏈的最高等級國際單位（SI單位）制。

另外還有兩個HbA_1c測定的指定比對方法，一個爲日本的K0500方法，另一個爲瑞典的MonoS方法。三個指定比對方法測定結果與IFCC測定結果之間存在非常確定的相關性，皆可用迴歸方程表示，方法特異性從高到低的順序依次爲：IFCC方法、瑞典方法、日本方法、美國方法，因此，測定結果從高到低的順序依次爲：美國結果、日本結果、瑞典結果、IFCC結果，如：美國NGSP的7% HbA_1c相當於IFCC的53 mmol/mol，日本的6.60/HbA_1c、，瑞典的6.1% HbA_1c。

13.2 A.2 標準物質

HbA_1c，有標準物質，一是國際的基準標準物質（Primary Reference Material，PRM），爲人血基質的IRMM/IFCC-466 HbA_1c（認證值：934 mmol/mol，不確定度：22 mmol/mol）及IRMM/IFCC-467 HbA₀（認證值>976 mmol/mol），由比利時的標準物質及測量研究所研製，兩個標準物質以一定的比例混合爲HbA_1c測定的參考方法校準；二是各個國家的標準物質，如我國的一級標準物質，爲人血紅蛋白溶液的GBW09181（認證值：38.4 mmol/mol，不確定度：1.6 mmol/mol）、GBW09182（認證值：52.68 mmol/ mol，不確定度：2.2 mmol/mol）及GBW09183（認證值：88.74 mmol/mol，不確定度：3.65 mmol/mol）。

13.3 A.3 IFCC參考系統在HbA1c標準化中的地位及應用

IFCC參考系統是HbA_1c測定標準化唯一有效的參考系統。廠商應提供可溯源至IFCC參考方法的證明。

13.4 A.4 參考系統的應用方式及範圍

參考系統的應用方式包括應用參考物質或參考方法：

——分析系統的溯源和量值傳遞；

——試劑的製備及質量評價；

——校準物的製備、定值及質量評價；

——新常規方法的發展及評價；

——室間質評計劃中的靶值確定；

——協作研究中分析的質量保證。

14 附錄B（資料性附錄）質控物均勻性評價實例

以採用單因素方差分析血液中HbA_1c的均勻性爲例。評價所用儀器應具有良好的精密度。

從樣品總體中隨機抽取21個（製備數量少於500個，可抽取10個）樣品，每個樣品重複測定3次（不少於2次），重複測定的樣品應分別單獨取樣，測定順序爲：第1次：1-2-3……-19-20-21；第2次：21-20-19……3-2-1；第3次：1-2-3……19-20-21。測定結果見表B.1。

表B.1 血液中HbA_1c測定結果   單位爲%HbA_1c

做單因素方差分析結果見表B.2。

表B.2 方差分析結果

顯著性水平大於0.05，樣品中HbA_1c是均勻的。

對測定中出現的異常值，在未查明原因之前，不應隨意剔除。

15 附錄C（資料性附錄）HbA1c測定室內質量控制程序

15.1 C.1 質控物的選擇

C.1.1 可選用凍幹或冰凍全血質控物，穩定性宜在1年以上，凍乾粉質控物在更換試劑或色譜柱時可能會有基質效應，程度取決於所用方法。

C.1.2 可以是已知值質控物，也可以是未知值質控物，至少兩個不同水平（高、低值）。

15.2 C.2 均值的建立

C.2.1 臨時均值的建立

選定質控物後，每個工作日測定每個水平質控物1次得到1個結果，以20個工作日的20個結果的平均值作爲質控物的臨時均值。

C.2.2 均值的調整

每個月底統計數據，將該月在控制限內的結果與以前的所有質控結果彙總，計算累積平均值，作爲下一個月的均值。

C.2.3 固定均值的建立

以最初20個數據和前5個月的在控制限內的數據的累積平均值作爲質控物有效期內的固定均值，以後每個月的室內質控採用此均值。

15.3 C.3 控制限的設定

15.3.1 C.3.1 控制限的表達

控制限一般採用標準差（s）的倍數來表達，如果用X代表均值（平均值），則：

a） 以X±2s作爲警告限；

b） 以X±3s爲失控限。

15.3.2 C.3.2 臨時控制限的設定

以確定臨時靶值的20個數據的標準差作爲臨時標準差，以此臨時標準差作爲下一個月的控制限。

15.3.3 C.3.3 控制限的調整

每個月底統計數據，將該月的在控結果與以前的所有質控結果彙總，計算累積標準差，作爲下一個月的控制限。

15.3.4 C.3.4 固定控制限的設定

以最初20個數據和前5個月在控數據的累積標準差作爲質控物有效期內的固定控制限，以後每個月的室內質控採用此控制限。

15.4 C.4 質量控制結果的記錄及質量控制圖的繪製

每次測定質控物後，都應記錄原始數據，如有條件，還應繪製質量控制圖。

15.5 C.5 失控判定規則

判定規則有多種，包括但不限於出現下列情況之一，即可判定爲失控：

a） 1次超出3s；

b） 連續2次超出2s;

c） 5～7次連續偏向橫軸的一側。

實驗室通常採用前兩種規則，後一種規則單獨依靠記錄往往難以發現，但在質量控制圖中可一目瞭然。

15.6 C.6 失控處理

質控物測定結果失控時，不能測定患者樣本及發出結果報告，應查找失控原因，直到查明原因並糾正失控，才能測定樣本併發出結果報告。

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