3 註解
免疫共沉澱(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用爲基礎的用於研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉澱X,那麼與X在體內結合的蛋白質Y也能沉澱下來。這種方法常用於測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用於確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。
6 免疫共沉澱實驗流程
(1)轉染後24-48 h 可收穫細胞,加入適量細胞裂解緩衝液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min, 細胞裂解液於4°C, 最大轉速離心30 min後取上清;
(2)取少量裂解液以備Western blot分析,剩餘裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜;
(3)取10μl protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩衝液洗3 次,每次3,000 rpm離心3 min;
(4)將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連;
(5)免疫沉澱反應後,在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1ml裂解緩衝液洗3-4次;最後加入15μl的2×SDS 上樣緩衝液,沸水煮5分鐘;
(6)SDS-PAGE, Western blotting或質譜儀分析。