3 概述
Small interfering RNA (siRNA)：是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。雙鏈RNA經酶切後會形成很多小片段，稱爲siRNA。SiRNA是siRISC的主要成員，激發與之互補的目標mRNA的沉默。
4 siRNA原理
RNA干涉（RNAi）在實驗室中是一種強大的實驗工具，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導序列特異的目標基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對特定信使RNA（mRNA）進行降解的指導要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產物，是RNAi發揮效應所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1調控完成。由於RNA 病毒入侵、轉座子轉錄、基因組中反向重複序列轉錄等原因,細胞中出現了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)編碼的蛋白質識別外源dsRNA，當dsRNA達到一定量的時候，Rde-1引導dsRNA與Rde-1編碼的Dicer（Dicer是一種RNaseIII 活性核酸內切酶，具有四個結構域：Argonaute家族的PAZ結構域，III型RNA酶活性區域，dsRNA結合區域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區）結合，形成酶-dsRNA複合體。在Dicer酶的作用下，細胞中的單鏈靶mRNA（與dsRNA具有同源序列）與dsRNA的正義鏈互換，原來dsRNA中的正義鏈被mRNA代替而從酶-dsRNA複合物中釋放出來，然後，在ATP的參與下，細胞中存在的一種RNA誘導的沉默複合體RNA-induced silencing complex （RISC，由核酸內切酶、核酸外切酶、解旋酶等構成，作用是對靶mRNA進行識別和切割）利用結合在其上的核酸內切酶的活性來切割dsRNA上處於原來正義鏈位置的靶mRNA分子中與dsRNA反義鏈互補的區域，形成21-23nt的dsRNA小片段，這些小片段即爲siRNA。RNAi干涉的關鍵步驟是組裝RISC和合成介導特異性反應的siRNA蛋白。siRNA併入RISC中，然後與靶標基因編碼區或UTR區完全配對，降解靶標基因，因此說siRNA只降解與其序列互補配對的mRNA。其調控的機制是通過互補配對而沉默相應靶位基因的表達，所以是一種典型的負調控機制。siRNA識別靶序列是有高度特異性的，因爲降解首先在相對於siRNA來說的中央位置發生，所以這些中央的鹼基位點就顯得極爲重要，一旦發生錯配就會嚴重抑制RNAi的效應。
5 siRNA的特點
1. 長度約在22nt左右。
2. 依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產物，所以具有Dicer產物的特點。
3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。
4. 是RISC組分。
5. siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。
6. siRNA是人工體外合成的，通過轉染進入人體內，是RNA干涉的中間產物。
7. 結構上， siRNA是雙鏈RNA。
8. 在Dicer酶的加工過程中， siRNA對稱地來源於雙鏈RNA的前體的兩側臂。
9. 在作用位置上， siRNA可作用於mRNA的任何部位。
6 siRNA製備方法
6.1 體外製備
許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定製週期長，特別是有特殊需求的。由於價格比其他方法高，爲一個基因合成3―4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。
最適用於：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究
不適用於：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素
體外轉錄
以DNA Oligo爲模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要佔用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。
最適用於：篩選siRNAs，特別是需要製備多種siRNAs，化學合成的價格成爲障礙時。
不適用於：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。
用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA製備siRNA
其他製備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法――製備一份混合有各種 siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200―1000鹼基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法製備長片斷雙鏈dsRNA ，然後用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA後，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由於siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要優點在於可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，爲研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。
不適用於：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療。
6.2 體內表達
前面的3種方法主要都是體外製備siRNAs，並且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而採用siRNA表達載體和基於PCR的表達框架則屬於：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在於不需要直接操作RNA。
siRNA表達載體
多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啓動子(pol III)中的一種，操縱一段小的髮夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啓動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啓動子和人H1啓動子。之所以採用RNA pol III啓動子是由於它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短髮夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆 到相應載體的pol III 啓動子下游。由於涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆 的序列是正確的。
siRNA表達載體的優點在於可以進行較長期研究――帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。
病毒載體也可用於siRNA表達，其優勢在於可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由於質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。
最適用於：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。
不適用於：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆 和測序等較爲費時、繁瑣的工作）。
siRNA表達框架
siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啓動子，一段髮夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗爲費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成爲篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啓動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那麼通過SECs篩選出的最有效的siRNA後，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用於穩定表達siRNA和長效抑制的研究。
這個方法的主要缺點是
①PCR產物很難轉染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）
②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發現導致結果不理想。