1 拼音
huà xué yào wù zhì liàng kòng zhì fēn xī fāng fǎ yàn zhèng jì shù zhǐ dǎo yuán zé
《化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》由國家食品藥品監督管理局於2005年3月18日國食藥監注[2005]106號印發。
指導原則編號：【H】GPH5-1
2 一、概述
保證藥品安全、有效、質量可控是藥品研發和評價應遵循的基本原則，其中，對藥品進行質量控制是保證藥品安全有效的基礎和前提。爲達到控制質量的目的，需要多角度、多層面來控制藥品質量，也就是說要對藥物進行多個項目測試，來全面考察藥品質量。一般地，每一測試項目可選用不同的分析方法，爲使測試結果準確、可靠，必須對所採用的分析方法的科學性、準確性和可行性進行驗證，以充分表明分析方法符合測試項目的目的和要求，這就是通常所說的對方法進行驗證。
方法驗證的目的是判斷採用的分析方法是否科學、合理，是否能有效控制藥品的內在質量。從本質上講，方法驗證就是根據檢測項目的要求，預先設置一定的驗證內容，並通過設計合理的試驗來驗證所採用的分析方法能否符合檢測項目的要求。
方法驗證在分析方法建立過程中具有重要的作用，併成爲質量研究和質量控制的組成部分。只有經過驗證的分析方法才能用於控制藥品質量，因此方法驗證是制訂質量標準的基礎。方法驗證是藥物研究過程中的重要內容。
本指導原則重點探討方法驗證的本質，將分析方法驗證的要求與所要達到的目的結合起來進行系統和規律性的闡述，重點闡述如何科學合理地進行論證方案的設計。
本指導原則主要包括方法驗證的一般原則、方法驗證涉及的三個主要方面、方法驗證的具體內容、對方法驗證的評價等內容。
本原則與其他相關技術指導原則一起構成較完整的質量控制指導原則。隨着我國新藥研發水平的不斷提高，對方法驗證的認識也會不斷深入，本指導原則將會逐步完善和修訂。 由於生物製品和中藥的特殊性，本原則主要適用於化學藥品。
3 二、方法驗證的一般原則
方法驗證的內容應根據檢測項目的要求，結合所採用分析方法的特點確定。
同一分析方法用於不同的檢測項目會有不同的驗證要求。例如，採用高效液相色譜法用於製劑的鑑別和雜質定量試驗應進行不同要求的方法驗證，前者重點要求驗證專屬性，而後者重點要求驗證專屬性、準確度、定量限。
4 三、方法驗證涉及的三個主要方面
4.1 （一）需要驗證的檢測項目
檢測項目是爲控制藥品質量，保證安全有效而設定的測試項目。根據
檢測項目的設定目的和驗證內容的不同要求，本指導原則將需驗證的檢測項目分爲鑑別、雜質檢查（限度試驗、定量試驗）、定量測定（含量測定、溶出度、釋放度等）、其他特定檢測項目等四類。
鑑別的目的在於判定被分析物是目標化合物，而非其它物質，用於鑑別的分析方法要求具有較強的專屬性。
雜質檢查主要用於控制主成分以外的雜質，如有機雜質、無機雜質等。雜質檢查可分爲限度試驗和定量試驗兩種情況。用於限度試驗的分析方法驗證側重專屬性和檢測限。用於定量試驗的分析方法驗證強調專屬性、準確度和定量限。
定量測定包括含量測定、製劑的溶出度測定等，由於此類項目對準確性要求較高，故所採用的分析方法要求具有一定的專屬性、準確度和線性。其他特定檢測項目包括粒徑分佈、旋光度、分子量分佈等，由於這些檢測項目的要求與鑑別、雜質檢查、定量測定等有所不同，對於這些項目的分析方法驗證應有不同的要求。
4.2 （二）分析方法
本指導原則所指分析方法是爲完成上述各檢測項目而設定和建立的測試方法，一般包括分析方法原理、儀器及儀器參數、試劑、系統適用性試驗、供試品溶液製備、對照品溶液製備、測定、計算及測試結果的報告等。
測試方法可採用化學分析方法和儀器分析方法。這些方法各有特點，同一測試方法可用於不同的檢測項目，但驗證內容可不相同。
4.3 （三）驗證內容
5 四、方法驗證的具體內容
5.1 （一）專屬性
專屬性係指在其他成分（如雜質、降解物、輔料等）可能存在下，採用的分析方法能夠正確鑑定、檢出被分析物質的特性。
通常，鑑別、雜質檢查、含量測定方法中均應考察其專屬性。如採用的方法不夠專屬，應採用多個方法予以補充。
1、鑑別反應
鑑別試驗應確證被分析物符合其特徵。專屬性試驗要求證明能與可能共存的物質或結構相似化合物區分，需確證含被分析物的供試品呈正反應，而不含被測成分的陰性對照呈負反應，結構相似或組分中的有關化合物也應呈負反應。
2、雜質檢查
作爲純度檢查，所採用的分析方法應確保可檢出被分析物中雜質的含量，如有關物質、重金屬、有機溶劑等。因此雜質檢查要求分析方法有一定的專屬性。
在雜質可獲得的情況下，可向供試品中加入一定量的雜質，證明雜質與共存物質能得到分離和檢出，並具適當的準確度與精密度。
在雜質或降解產物不能獲得的情況下，專屬性可通過與另一種已證明合理但分離或檢測原理不同、或具較強分辨能力的方法進行結果比較來確定。或將供試品用強光照射，高溫，高溼，酸、鹼水解及氧化的方法進行破壞（製劑應考慮輔料的影響），比較破壞前後檢出的雜質個數和量。必要時可採用二極管陣列檢測和質譜檢測，進行色譜峯純度檢查。
3、含量測定
含量測定目的是得到供試品中被分析物的含量或效價的準確結果。 在雜質可獲得的情況下，對於主成分含量測定可在供試品中加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，並與未加雜質和輔料的供試品比較測定結果。
在雜質或降解產物不能獲得的情況下，可採用另一個經驗證了的或藥典方法進行比較，對比兩種方法測定的結果。也可採用破壞性試驗（強光照射，高溫，高溼，酸、鹼水解及氧化），得到含有雜質或降解產物的試樣，用兩種方法進行含量測定，比較測定結果。必要時進行色譜峯純度檢查，證明含量測定成分的色譜峯中不包含其他成分。
5.2 （二）線性
線性係指在設計的測定範圍內，檢測結果與供試品中被分析物的濃度（量）直接呈線性關係的程度。
線性是定量測定的基礎，涉及定量測定的項目，如雜質定量試驗和含量測定均需要驗證線性。
應在設計的測定範圍內測定線性關係。可用一貯備液經精密稀釋，或分別精密稱樣，製備一系列被測物質濃度系列進行測定，至少製備 5 個濃度。以測得的響應信號作爲被測物濃度的函數作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進行線性迴歸。
必要時，響應信號可經數學轉換，再進行線性迴歸計算，並說明依據。
5.3 （三）範圍
範圍係指能夠達到一定的準確度、精密度和線性，測試方法適用的試樣中被分析物高低限濃度或量的區間。 範圍是規定值，在試驗研究開始前應確定驗證的範圍和試驗方法。可以採用符合要求的原料藥配製成不同的濃度，按照相應的測定方法進行試驗。
範圍通常用與分析方法的測試結果相同的單位（如百分濃度）表達。涉及到定量測定的檢測項目均需要對範圍進行驗證，如含量測定、含量均勻度、溶出度或釋放度、雜質定量試驗等。
1、含量測定
範圍應爲測試濃度的 80％～100％或更寬。
2、製劑含量均勻度
範圍應爲測試濃度的 70％～130％。根據劑型特點，如氣霧劑、噴霧劑，必要時，範圍可適當放寬。
對於溶出度，範圍應爲限度的±20％；如規定限度範圍，則應爲下限的-20％至上限的+20％。
對於釋放度，如規定限度範圍爲，從 1 小時後爲 20％至 24 小時後爲90％，則驗證範圍應爲 0～110％。
4、雜質
雜質測定時，範圍應根據初步實測結果，擬訂出規定限度的±20％。
如果含量測定與雜質檢查同時測定，用面積歸一化法，則線性範圍應爲雜質規定限度的-20％至含量限度（或上限）的+20％。
5.4 （四）準確度
準確度係指用該方法測定的結果與真實值或認可的參考值之間接近的程度。有時也稱真實度。
一定的準確度爲定量測定的必要條件，因此涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證準確度，如含量測定、雜質定量試驗等。
準確度應在規定的範圍內建立，對於製劑一般以回收率試驗來進行驗證。試驗設計需考慮在規定範圍內，製備 3 個不同濃度的試樣，各測定 3次，即測定 9 次，報告已知加入量的回收率（％）或測定結果平均值與真實值之差及其可信限。
1、含量測定
原料藥可用已知純度的對照品或符合要求的原料藥進行測定，或用本法所得結果與已建立準確度的另一方法測定的結果進行比較。
製劑可用含已知量被測物的各組分混合物進行測定。如不能得到製劑的全部組分，可向製劑中加入已知量的被測物進行測定，必要時，與另一個已建立準確度的方法比較結果。
2、雜質定量試驗
雜質的定量試驗可向原料藥或製劑中加入已知量雜質進行測定。如果不能得到雜質，可用本法測定結果與另一成熟的方法進行比較，如藥典方法或經過驗證的方法。
如不能測得雜質的相對響應因子，可在線測定雜質的相關數據，如採用二極管陣列檢測器測定紫外光譜，當雜質的光譜與主成分的光譜相似，則可採用原料藥的響應因子近似計算雜質含量（自身對照法）。並應明確單個雜質和雜質總量相當於主成分的重量比（％）或面積比（％）。
5.5 （五）精密度
精密度係指在規定的測試條件下，同一均質供試品，經多次取樣進行一系列檢測所得結果之間的接近程度（離散程度）。
精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。用標準偏差或相對標準偏差表示時，取樣測定次數應至少 6 次。
1、重複性
重複性係指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內，由同一分析人
員測定所得結果的精密度。
重複性測定可在規定範圍內，至少用 9 次測定結果進行評價，如製備3 個不同濃度的試樣，各測定 3 次，或 100％的濃度水平，用至少測定 6 次的結果進行評價。
2、中間精密度
中間精密度係指在同一實驗室，由於實驗室內部條件改變，如時間、分析人員、儀器設備、測定結果的精密度。
3、重現性
5.6 （六）檢測限
檢測限係指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準確定量。
該驗證指標的意義在於考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此對雜質限度試驗，需證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質。
1、直觀法
檢測限的測定是通過對一系列已知濃度被測物的試樣進行分析，並以能準確、可靠檢測被測物的最小量或最低濃度來建立。
2、信噪比法
用於能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與噪聲信號進行比較，計算可檢出的最低濃度或量。一般以信噪比爲 3：1 時相應的濃度或注入儀器的量確定檢測限。
其他方法有基於工作曲線的斜率和響應的標準偏差進行計算的方法等。
無論用何種方法，均應用一定數量的試樣，其濃度爲近於或等於檢測限，進行分析，以可靠地測定檢測限。
5.7 （七）定量限
定量限係指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度和精密度。
定量限體現了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質能夠被準確測出。
常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比爲 10：1 時相應的濃度或注入儀器的量進行確定。
1、直觀法
定量限一般通過對一系列含有已知濃度被測物的試樣進行分析，在準確度和精密度都符合要求的情況下，來確定被測物能被定量的最小量。
2、信噪比法
用於能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與噪聲信號進行比較，計算出可檢出的最低濃度或量。一般可信噪比爲 10：1。其他方法有基於工作曲線的斜率和響應的標準偏差進行計算的方法等。
無論用何種方法，均應用一定數量的試樣，其濃度爲近於或等於定量限，進行分析，以可靠地測定定量限。
5.8 （八）耐用性
耐用性係指測定條件發生小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。耐用性主要考察方法本身對於可變試驗因素的抗干擾能力。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。
典型的變動因素包括：液相色譜法中流動相的組成、流速和 pH 值、不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫等。氣相色譜法中載氣及流速、不同廠牌或批號的色譜柱、固定相、擔體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。經試驗，應說明小的變動能否符合系統適用性試驗要求，以確保方法有效。
5.9 （九）系統適用性試驗
對一些儀器分析方法，在進行方法驗證時，有必要將分析設備、電子儀器與實驗操作、測試樣品等一起當作完整的系統進行評估。系統適用性便是對整個系統進行評估的指標。系統適用性試驗參數的設置需根據被驗證方法類型而定。
色譜方法對分析設備、電子儀器的依賴程度較高，因此所有色譜方法均應進行該指標驗證，並將系統適用性作爲分析方法的組成部分。具體驗證參數和方法參考中國藥典有關規定。
6 五、方法再驗證
在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、製劑處方改變、分析方法發生部分改變等，均有必要對分析方法再次進行全面或部分驗證，以保證分析方法可靠，這一過程稱爲方法再驗證。
當原料藥合成工藝發生改變時，可能引入新的雜質，雜質檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關物質檢查方法能夠檢測新引入的雜質，且新引入的雜質對主成份的含量測定應無干擾。
當製劑的處方組成改變、輔料變更時，可能會影響鑑別的專屬性、溶出度和含量測定的準確度，因此需要對鑑別、含量測定方法再驗證。當原料藥產地來源發生變更時，可能會影響雜質檢查和含量測定的專屬性和準確度，因此需要對雜質檢查方法和含量測定方法進行再驗證。
當質量標準中某一項目分析方法發生部分改變時，如採用高效液相色譜法測定含量時，檢測波長發生改變，則需要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內容的驗證，證明修訂後分析方法的合理性、可行性。
同樣，已有國家標準的藥品質量研究中，基於申報的原料藥合成工藝、製劑處方中的輔料等一般無法保證與已上市藥品的一致性，需對質量標準中部分項目進行方法的再驗證。
7 六、對方法驗證的評價
總體上，方法驗證應圍繞驗證目的和一般原則來進行，方法驗證內容的選擇和試驗設計方案應系統、合理，驗證過程應規範嚴謹。
並非每個檢測項目的分析方法都需進行所有內容的驗證，但同時也要注意驗證內容應充分，足以證明採用的分析方法的合理性。如雜質限度試驗一般需要驗證專屬性和檢測限，而對於精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目，則一般不需要進行驗證。
方法驗證內容之間相互關聯，是一個整體。因此不論從研發角度還是評價角度，方法驗證均注重整體性和系統性。
例如，對於鑑別項目所需要的專屬性，一般一種分析方法不太可能完全鑑別被分析物，此時採用兩種或兩種以上分析方法可加強鑑別項目的整體專屬性。
在方法驗證內容之間也存在較多的關聯性，可以相互補充。如原料藥含量測定採用容量分析法時，由於方法本身原因，專屬性略差，但假如在雜質檢測時採用了專屬性較強的色譜法，則一般認爲整個檢測方法也具有較強的專屬性。
總之，由於實際情況較複雜，在方法驗證過程中，不提倡教條地去進行方法驗證。此外，越來越多的新方法不斷被用於質量控制中，對於這些方法如何進行驗證需要具體情況具體分析，而不能照搬本指導原則。
8 七、參考文獻
1. FDA.Guidance for Industry:analytical procedures and methods validation,chemistry,manufacturing,and controls documentation（Draft）, 2000.8。
2. ICH Q2A.Test on Validation of Analytical Procedures
3. ICH Q2B.Validation of Analytical Procedures:Methodology
9 八、著者
《化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》課題研究組