1 拼音
W S / T 7 9 2 — 2 0 2 1 rì běn xuè xī chóng kàng tǐ jiǎn cè biāo zhǔn méi lián miǎn yì xī fù shì yàn fǎ
3 基本信息
ICS 11.020
CCS C 61
中華人民共和國衛生行業標準WS/T 792—2021《日本血吸蟲抗體檢測標準 酶聯免疫吸附試驗法》（Detection standard of antibody against Schistosoma japonicum—Enzyme-linkedimmunosorbent assay）由中華人民共和國國家衛生健康委員會於2021年11月23日《關於發佈《囊尾蚴病診斷標準》等3項推薦性衛生行業標準的通告》（國衛通〔2021〕11號）發佈，自2022年05月01日起實施。
4 發佈通知
關於發佈《囊尾蚴病診斷標準》等3項推薦性衛生行業標準的通告
國衛通〔2021〕11號
現發佈《囊尾蚴病診斷標準》等3項推薦性衛生行業標準，編號和名稱如下：
WST 381—2021 囊尾蚴病診斷標準（代替WS/T 381—2012）
WST 791—2021 鉤蟲檢測及蟲種鑑定標準 鉤蚴培養法
WST 792—2021 日本血吸蟲抗體檢測標準 酶聯免疫吸附試驗法
上述標準自2022年5月1日起施行，WS/T 381—2012同時廢止。
特此通告。
國家衛生健康委
2021年11月23日
5 前言
本標準由國家衛生健康標準委員會寄生蟲病標準專業委員會負責技術審查和技術諮詢，由中國疾病預防控制中心負責協調性和格式審查，由國家衛生健康委疾病預防控制局負責業務管理、法規司負責統籌管理。
本標準起草單位：杭州醫學院（浙江省醫學科學院）、中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所、安徽省血吸蟲病防治研究所、寧波市疾病預防控制中心、江西省寄生蟲病防治研究所。
本標準主要起草人：聞禮永、嚴曉嵐、熊彥紅、鄭彬、張劍鋒、汪天平、俞麗玲、許國章、林丹丹、周曉農。
6 標準全文
6.1 1 範圍
本標準適用於各級疾病預防控制機構和醫療機構對人體血清中日本血吸蟲抗體的檢測。
6.2 2 規範性引用文件
本標準沒有規範性引用文件。
6.3 3 術語和定義
下列術語和定義適用於本標準。
3.1
酶聯免疫吸附試驗 enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA
利用抗原抗體之間專一性鍵結之特性，對檢體進行檢測；由於結合於固體承載物上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設計其鍵結機制後，配合酵素呈色反應，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，並可利用呈色之深淺進行定量分析的試驗。
3.2
可溶性蟲卵抗原 soluble egg antigen
血吸蟲蟲卵經勻漿和超聲破碎等處理後離心收集的上清液，含蛋白質、糖蛋白、多糖等多種成分複合物。
3.3
金黃色葡萄球菌蛋白A staphylococal protein A
從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質，能與人及多種哺乳動物血清中IgG分子的Fc片段結合，作爲第二抗體。
6.4 4 儀器設備
6.4.1 4.1 臺式低速離心機
最高轉速大於或等於2 500 r/min，或最大相對離心力大於或等於800 g。
6.4.2 4.2 酶標專用比色計
帶有450 nm、492 nm和630 nm濾光片，分辨率0.001光密度（optical density，OD）值。
6.4.3 4.3 恆溫水浴箱
WS/T 792—20213控溫範圍 5 ℃～99.9 ℃，溫度分辨率/波動度0.1 ℃/±0.5 ℃。
6.4.4 4.4 微量移液器
量程範圍1 μL～10 μL，增量0.1 μL；量程範圍10 μL～100 μL，增量1 μL；量程範圍100 μL～1000μL，增量5 μL。
6.5 5 試劑或材料
6.5.1 5.1 酶標反應板
6.5.2 5.2 包被抗原
6.5.3 5.3 包被緩衝液
0.05 mol/L pH9.6 碳酸鹽緩衝液，製備方法見附錄A.2。
6.5.4 5.4 樣品洗滌液
含0.05% 吐溫-20 的 0.01 mol/L pH7.4 磷酸鹽緩衝液（PBS-T），製備方法見附錄A.3。
6.5.5 5.5 封閉液
6.5.6 5.6 陽性對照血清
6.5.7 5.7 陰性對照血清
6.5.8 5.8 樣品稀釋液
含0.1% BSA的PBS-T，製備方法見附錄A.7。
6.5.9 5.9 酶標記物
金黃色葡萄球菌蛋白A標記辣根過氧化物酶，製備方法見附錄A.8。
6.5.10 5.10 底物緩衝液
6.5.11 5.11 底物使用液
3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺（TMB）或鄰苯二胺（OPD），製備方法見附錄A.10。
6.5.12 5.12 終止液
6.6 6 檢測步驟
示意圖和注意事項見附錄 B。
6.6.1 6.1 樣本準備
採集末梢血100 μL或靜脈血2 mL，室溫下放置至血塊收縮後，800 g 離心5 min，分離出血清進行檢測。
6.6.2 6.2 樣本檢測
6.6.2.1 6.2.1 抗原包被
於酶標反應板凹孔中，加入 100 μL 以包被緩衝液 1:1000～1:3000 稀釋的可溶性蟲卵抗原，置4℃冰箱過夜。次日，傾去抗原，用樣品洗滌液洗滌 3 次，每次 3 min～5 min，甩幹。爲減少非特異性反應，小孔中可再加 100 μL 封閉液過夜，甩幹。4 ℃保存備用。
6.6.2.2 6.2.2 加受檢和對照血清
用樣品稀釋液 1:100 比例稀釋受檢者、陰性對照和陽性對照血清，各取100 μL 稀釋血清加入酶標反應板的小孔中，每板同時設置兩孔陰性對照血清、一孔陽性對照血清和一孔樣品稀釋液空白對照，置恆溫水浴箱內 37 ℃孵育 1 h。如 6.2.1 洗滌甩幹。
6.6.2.3 6.2.3 加酶標記物
用樣品緩衝液 1:1 000～1:4 000 比例稀釋酶標記物，取 100 μL 加入酶標反應板的小孔中，置恆溫水浴箱內 37 ℃孵育 1 h。如 6.2.1 洗滌甩幹。
6.6.2.4 6.2.4 加底物
每孔加入新配置的底物使用液 100 μL，置恆溫水浴箱內 37 ℃反應 30 min。
6.6.2.5 6.2.5 終止反應
每孔加入 50 μL 終止液終止反應。
6.6.2.6 6.2.6 結果判定
以空白對照調零，讀取酶標專用比色計上各孔 450 nm（TMB 爲底物）或492 nm（OPD爲底物）波長的 OD 值，以 630 nm 作爲參比波長。
以受檢樣本孔 OD 值/陰性對照孔 OD 值（P/N）≥2.1 倍判爲陽性。當陰性對照OD值低於0.05時，按 0.05 計算。
7 附錄A（資料性）主要試劑材料製備方法
7.1 A.1 包被抗原
取凍幹蟲卵，0.01%硫柳汞生理鹽水配製懸液，組織勻漿器研磨並置﹣20 ℃反覆凍融3次，10000g離心30 min，取上清液。測定蛋白含量後，用硫柳汞生理鹽水稀釋至0.75 mg/mL，分裝後置﹣20℃保存備用。
7.2 A.2 包被緩衝液
稱取碳酸鈉（Na2CO3）1.59 g，碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93 g，加去離子水（或蒸餾水）至1000mL，即爲 0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩衝液，密封蓋好，4 ℃保存備用，有效期2周。
7.3 A.3 樣品洗滌液（PBS-T）
稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2 g，十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）2.9 g，氯化鈉（NaCl）8.0 g，氯化鉀（KCl）0.2 g，加去離子水（或蒸餾水）至1 000 mL，即爲0.15 mol/L pH7.4磷酸鹽緩衝液（PBS），再加0.5 mL 吐溫-20，即配成含0.05％ 吐溫-20的洗滌緩衝液（PBS-T），4 ℃保存備用。
7.4 A.4 封閉液
稱取2 g BSA，加入PBS-T緩衝液100 mL，即爲2%牛血清白蛋白，4 ℃保存備用。
7.5 A.5 陽性對照血清
選擇體重2.5 kg～3.0 kg的健康家兔，每隻感染800條～1 000條日本血吸蟲尾蚴，飼養60 d後，抽取心臟全血，分離血清，混合後按每支0.1 mL分裝於微量離心管凍幹，作爲陽性對照血清。陽性對照血清檢測效價不低於1：640。
7.6 A.6 陰性對照血清
選擇體重2.5 kg～3.0 kg的健康家兔，抽取心臟全血，分離血清，選出沒有溶血的血清滅活補體（56℃滅活30 min），混合後按每支0.1 mL分裝微量離心管凍幹，作爲陰性對照血清。陰性對照血清檢測效價不高於1：5。
7.7 A.7 樣品稀釋液
稱取0.1 g BSA，加入PBS-T緩衝液至100 mL，4 ℃保存備用。
7.8 A.8 酶標記物
WS/T 792—20216常用過碘酸鈉法標記。稱取5 mg辣根過氧化物酶（HRP）溶於0.5 mL蒸餾水中，加入新鮮配製的0.06mol/L過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5 mL，混勻置4 ℃ 30 min，取出加入0.16 mol/L 乙二醇水溶液0.5mL，室溫放置30 min後，加入含5 mg純化抗體的水溶液1 mL，混勻並裝透析袋，在0.05 mol/LpH9.5碳酸緩衝液緩慢攪拌透析6 h或過夜，然後加5 mg/mL 硼氫化鈉（NaBH4）溶液0.2 mL，置4 ℃2 h。將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，4 ℃ 30 min後離心，將所得沉澱物溶於少許0.02 mol/LpH7.4磷酸鹽緩衝液中，並透析過夜，次日離心除去不溶物，即得酶-抗體結合物，用磷酸鹽緩衝液加至5mL進行測定後冷凍乾燥保存。
7.9 A.9 底物緩衝液
稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4）28.4 g，加去離子水（或蒸餾水）至1 000 mL，爲A液；稱取檸檬酸19.2g，加去離子水（或蒸餾水）至1 000 mL，爲B液。取A液25.7 mL，B液24.3 mL混合，並加去離子水（或蒸餾水）50 mL，即爲 pH 5.0磷酸-檸檬酸緩衝液。現配現用。
7.10 A.10 底物使用液
A.10.1 TMB使用液
稱取100 mg TMB溶解在10 mL二甲基亞碸（DMSO）或無水乙醇中，配成1%TMB溶液，4℃保存6個月以內使用。用底物緩衝液9.9 mL加入0.1 mL 1% TMB保存液，使用前，按每1 mL TMB溶液加入30%過氧化氫（H2O2）1 μL，混勻後立即使用。
A.10.2 OPD使用液
稱取4 mg OPD溶解在10 mL底物緩衝液中，再加30% H2O2 15 μL，避光保存。使用前現配現用。A.11 終止液
8 附錄B（資料性）檢測步驟和注意事項
8.1 B.1 檢測步驟
檢測步驟示意圖見圖B.1。
圖B.1 檢測步驟示意圖
8.2 B.2 注意事項
B.2.1 樣本採集與保存：末梢血一般採用聚乙烯塑料管採集，塑料管孔徑2 mm，長度10 cm。靜脈血一般採用一次性真空採血管採集。全血採集後應在4 h內進行血清分離。血清樣本不能混有紅細胞或被細菌污染，血清量應不少於10 μL。血清樣本若不能及時檢測，可在2 ℃～8 ℃保存3 d～5 d，長時間保存應置於﹣20 ℃以下冷凍保存。
B.2.2 試劑準備：檢測試劑如果從冰箱取出，應放在室溫條件下平衡30 min以上再行使用。
B.2.3 加樣：使用移液器加樣，每檢測一個樣本應更換吸頭，加樣時應將液體加在孔底，避免產生氣泡，從而影響吸液量的準確性；加底物和終止液時也要去除孔內氣泡，避免影響樣本OD值。
B.2.4 洗滌：每次洗滌時一定要徹底洗淨甩幹，否則影響結果。
B.2.5 加樣後的酶標反應板應封板（加蓋玻璃板或一次性封口膜，或放置密閉溼盒內）後，方可置37℃恆溫水浴箱溼育。
B.2.6 加底物前，酶標反應板經洗滌甩幹後，不宜在空氣中暴露過久，應速加底物，以免影響酶的活力而影響結果。底物溶液需放置在棕色瓶（或其它避光瓶）內，溶液應清晰無色，反應需在暗處進行。底物OPD有一定毒性，應避免污染。
9 參考文獻
[1] WS 261—2006 血吸蟲病診斷標準.
[2] 吳觀陵.人體寄生蟲學（第4版）[M].北京：人民衛生出版社，2013.
[3] 聞禮永.血吸蟲病監測手冊[M].北京：人民衛生出版社，2014.
[4] 周曉農.血吸蟲病消除手冊[M].上海：上海科學技術出版社，2021.
[5] Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assayofimmunoglobulin G[J]. Immunochemistry, 1971, 8(9):871-874.
[6] 郭春祥，郭錫瓊. 介紹一種簡單、快速、高效的辣根過氧化物酶標記抗體的過碘酸鈉法[J]. 上海免疫學雜誌，1983， 3(2)：97-100.
