3 基本信息
ICS 11.020
C 59
中華人民共和國衛生行業標準WS/T 590—2018《基孔肯雅熱診斷》（Diagnosis for chikungunya fever）由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會2018年3月6日《關於發佈〈丙型肝炎診斷〉等7項衛生行業標準的通告》（國衛通〔2018〕4號）發佈，2018年8月1日起實施。
4 發佈通知
關於發佈《丙型肝炎診斷》等7項衛生行業標準的通告
國衛通〔2018〕4號
現發佈《丙型肝炎診斷》等7項衛生行業標準，編號和名稱如下：
一、強制性衛生行業標準
WS 213—2018 丙型肝炎診斷（代替WS 213—2008 ）
WS 216—2018 登革熱診斷（代替WS 216—2008 ）
WS 273—2018 梅毒診斷（代替WS 273—2007 ）
WS 291—2018 麻風病診斷（代替WS 291—2008）
二、推薦性衛生行業標準
WS/T 590—2018 基孔肯雅熱診斷
上述標準自2018年8月1日起施行,WS 213—2008 、WS 216—2008、WS 273—2007、WS 291—2008 同時廢止。
特此通告。
國家衛生計生委
2018年3月6日
5 前言
本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。
本標準起草單位：廣東省疾病預防控制中心、廣州市第八人民醫院、中國疾病預防控制中心、中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所、東莞市人民醫院。
本標準主要起草人：何劍峯、張復春、李德新、王世文、王建、柯昌文、鍾豪傑、殷文武、殷思純、郭汝寧。
6 標準正文
基孔肯雅熱診斷
6.1 1 範圍
本標準規定了基孔肯雅熱的診斷依據、診斷原則、診斷及鑑別診斷。
本標準適用於全國各級各類醫療衛生機構及其醫務人員對基孔肯雅熱的診斷。
6.2 2 縮略語
下列縮略語適用於本文件。
CHIKV：基孔肯雅病毒（chikungunya virus）
ELISA：酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay）
IgG：免疫球蛋白G(immunoglobulin G)
IgM：免疫球蛋白M(immunoglobulin M)
RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)
RT-PCR：逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction)
6.3 3 診斷依據
6.3.1 3.1 流行病學史
發病前 12 d 內，曾經到過基孔肯雅熱流行區或居住場所或工作場所周圍曾有本病發生。
6.3.2 3.2 臨牀表現
3.2.1 發熱：急起高熱，體溫可達 39℃以上，一般發熱 1 d～7 d。部分病人熱退後再次出現發熱，表現爲雙峯熱，持續 3 d～5 d 恢復正常。常伴有寒戰、頭痛、背痛、全身肌肉疼痛，畏光，噁心、嘔吐等症狀。
3.2.2 關節疼痛：關節疼痛主要累及手腕和踝趾等小關節，也可涉及膝和肩等大關節，腕關節受壓引起劇烈疼痛是本病的重要特徵。急性期多個關節出現疼痛或關節炎表現，可有腫脹或僵硬，晨間較重，嚴重者不能活動，通常 1 周～3 周緩解。部分病例關節疼痛可持續數月。
3.2.3 皮疹：發病後 2 d～5 d，半數以上病例在軀幹、四肢伸側、手掌和足底出現紅色斑丘疹或紫癜，疹間皮膚多爲正常，部分伴有瘙癢感，數天後消退，可伴脫屑。
6.3.3 3.3 實驗室檢查
3.3.1 急性期血清特異性 IgM 抗體陽性（見附錄 A 中 A.1）。
3.3.2 恢復期血清特異性抗體（IgG 或中和抗體）滴度比急性期升高 4 倍及以上，或急性期抗體陰性而恢復期抗體陽性（見附錄 A 中 A.2、A.3）。
3.3.3 急性期血清標本分離到基孔肯雅病毒（見附錄 B 中 B.1）。
3.3.4 急性期血清標本檢測到基孔肯雅病毒核酸（見附錄 B 中 B.2）。
6.4 4 診斷原則
依據患者的流行病學史、臨牀表現及實驗室檢查結果進行綜合判斷。在從未發生過基孔肯雅熱流行的地區，應以實驗室檢查依據爲主。
6.5 5 診斷
6.5.1 5.1 疑似病例
符合3.1，3.2.1、3.2.2和/或 3.2.3，並排除登革熱和/或其他發熱伴出疹性疾病者。
6.5.2 5.2 臨牀診斷病例
符合5.1，並同時符合3.3.1。
6.5.3 5.3 確診病例
符合5.1或5.2，並同時符合3.3.2、3.3.3、3.3.4中任一項。
6.5.4 6 鑑別診斷
基孔肯雅熱應與登革熱、甲病毒（Alphavirus）感染、傳染性紅斑、感染後關節炎（包括風溼熱）、猩紅熱、立克次體病（斑疹傷寒、恙蟲病）、麻疹、藥疹等相鑑別。參見附錄C與附錄D。
7 附錄A（規範性附錄）基孔肯雅熱血清學檢測方法
7.1 A.1 酶聯免疫法檢測基孔肯雅病毒（chikungunya virus，以下簡稱CHIKV）IgM抗體(IgM抗體捕獲酶聯免疫吸附試驗)
7.1.1 A.1.1 原理
首先用抗人IgM µ鏈抗體（捕獲抗體）包被96孔板，如果待檢血清中存在CHIKV抗IgM抗體，則與包被的捕獲抗體結合，然後再與CHIKV抗原結合，最後與加入酶標抗CHIKV抗體結合，酶與顯色底物相互作用就會出現顯色反應。
7.1.2 A.1.2 材料和試劑
材料和試劑如下：
a) 包被液：碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝液，pH 9.6，1.59 g Na2CO3和 2.93 g NaHCO3溶解於 1 L 水中；
b) 洗液：磷酸鹽緩衝液（PBS），含 0.05％吐溫 20，pH 7.2；
c) 封閉液：含 5％奶粉和 0.05％吐溫 20 的 PBS；
g) 酶標抗體：辣根過氧化物酶標記的 CHIKV 單克隆抗體；
h) 酶底物：TMB；
i) 終止液：2N H2SO4；
j) 臨牀標本：急性期病人血清和/或腦脊髓液標本；陽性和陰性血清對照；
k) 設備：平底 96 孔板，洗板機，酶標儀，恆溫箱，單通道和多通道移液器，試劑儲液槽，保鮮袋，吸水紙。
7.1.3 A.1.3 檢測方法
按以下步驟操作：
a) 用記號筆在酶標板上標記實驗編號，明確每份臨牀標本的位置。
b) 用 pH 9.6 的包被液按 1∶2 000 比例稀釋抗人 IgMμ 鏈抗體，按 75 µL/孔加入到 96 孔板的孔中，4℃孵育過夜。
c) 倒掉抗體包被液，把板中剩餘液體在吸水紙上吸乾。每孔加入封閉液 200 µL 封閉反應板。室溫孵育 30 min。
d) 用洗液在自動洗板機上洗板 5 次。每次洗滌要保證每孔加滿洗液。
e) 病人血清用稀釋液進行 1∶100 稀釋，腦脊髓液進行 1:10 稀釋，然後按 50 µL/孔，各加 2 孔，同時用稀釋液按1∶100比例稀釋陽性對照血清和陰性對照血清，各加2孔。37℃溼盒孵育1 h。洗滌 5 遍。
f) 稀釋病毒抗原和細胞抗原。每排左邊 1 孔按 50 µL/孔加入病毒抗原，每排右邊 1 孔按 50 µL/孔加入細胞抗原。4℃溼盒孵育過夜。洗滌 5 遍。
g) 按 50 µL/孔加入辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，37℃溼盒孵育 1 h，洗板 5 遍。
h) 所有孔中加 50 µL/孔的 TMB 底物液，包括 1 孔未加樣的空白對照孔。避光室溫孵育 10 min。抗體陽性的孔中會逐漸顯示出藍色。
i) 所有孔中加 50 µL/孔的終止液，顯示藍色的孔此時會變成黃色。把酶標板放入酶標儀中，在450 nm 波長處讀取 OD 值。
7.1.4 A.1.4 結果判斷
結果判斷規則如下：
a) 如果陽性對照血清病毒抗原孔的光密度（OD）值與細胞抗原孔的 OD 值之比≥2.1，檢測結果有效；
b) 如果待檢標本病毒抗原孔的 OD 值與細胞抗原孔的 OD 值之比≥2.1，則可判定待檢標本中 CHIKV IgM 抗體陽性。
7.1.5 A.1.5 意義
病人血清或腦脊髓液標本中CHIKV IgM抗體陽性，表示病人新近感染CHIKV，可作爲病例診斷的依據。
7.2 A.2 間接免疫熒光法（IFA）檢測基孔肯雅病毒IgG抗體
7.2.1 A.2.1 原理
IFA就是先用待檢血清中的特異抗體（第一抗體）與固定在玻片上的CHIKV抗原反應，如果血清中存在CHIKV特異性IgM和IgG抗體，就會與熒光標記的抗人IgM和IgG抗體（第二抗體）結合，熒光顯微鏡下可見有特異熒光。
7.2.2 A.2.2 材料和試劑
材料和試劑如下：
a) 設備：10 µL、100 µL、200 µL 和 1 000 µL 移液器各一支；熒光顯微鏡；CHIKV 抗原片（可用BHK-21、Vero 或 C6/36 等感染細胞製備，低溫、乾燥、密封保存）；蓋玻片；
b) 試劑：CHIKV 抗體陽性對照血清、陰性對照血清；熒光素標記抗人 IgG 和 IgM 熒光抗體；待檢患者血清標本；樣品稀釋液；磷酸鹽緩衝液（PBS，pH 7.2）；吐溫 20。
7.2.3 A.2.3 檢測方法
按以下步驟操作：
b) 如果檢測 IgG 抗體，先用標本稀釋液稀釋待檢血清，從 1∶10 開始，倍比稀釋至所需要的滴度；
c) 用移液器取適量稀釋標本加到每個反應區域（標本量以覆蓋所有反應區爲準），避免溢出和產生氣泡；
d) 將加有標本的抗原片放置在溼盒內，37℃溫箱孵育 30 min；
e) 用含 2‰ 吐溫 20 的 PBS 沖洗抗原片，然後再漂洗 5 min；
f) 取出抗原片，用吸水紙從抗原片背面和側面擦去洗液（不得擦拭反應區域），加入適量的熒光素標記抗人 IgM 或 IgG 熒光抗體,分別用於檢測 IgM 或 IgG 抗體（熒光抗體在使用前鬚根據介紹用 PBS 稀釋）；
g) 將抗原片放置在避光的溼盒內，37℃溫箱孵育 30 min；
h) 用含 2‰ 吐溫 20 的 PBS 沖洗抗原片，再將抗原片放入含有 1∶8 000 伊文思藍的吐溫 20 的 PBS中漂洗 5 min；
i) 取出抗原片，用吸水紙從抗原片背面和側面擦去洗液（不得擦拭反應區域），用甘油緩衝液封片，蓋上蓋玻片，避免產生氣泡；
j) 熒光顯微鏡下觀察結果。
7.2.4 A.2.4 結果判斷
結果判斷規則如下：
a) 特異性熒光顆粒在鏡下呈現黃綠色，如果抗原片的細胞胞漿中呈現出均勻的顆粒狀熒光，可判斷 CHIKV 特異抗體陽性。
b) 根據熒光光亮度和陽性細胞在細胞總數中所佔的比例可將熒光反應大致區分爲“+ ～ ++++”，無特異熒光者爲陰性。檢測抗體滴度時，抗體滴度爲特異熒光達“++”時最高血清稀釋度的倒數。
c) 如果陽性對照顯示非特異性熒光或陰性對照顯示清晰的熒光，試驗則不成立，需重複檢測。
7.2.5 A.2.5 意義
恢復期血清IgG抗體陽轉，或IgG抗體滴度較急性期有4倍及以上增高，均表示病人近期感染了CHIKV，可作爲病例確診的依據。
7.3 A.3 蝕斑減少中和試驗檢測基孔肯雅病毒中和抗體
7.3.1 A.3.1 原理
血清中CHIKV中和抗體可阻斷病毒吸附細胞，而未被中和的病毒仍具有感染細胞的能力，可導致單層細胞病變、脫落等，形成一個侷限性的變性細胞區，該區稱之爲蝕斑。在單層細胞上覆蓋含有活性染料的營養瓊脂可指示蝕斑的多少。“蝕斑”是感染了病毒的細胞，病變死亡後無法被染料染上顏色，形成空斑，而未感染病毒的細胞可被活性染料着色，通過顏色的對比可判定蝕斑量。檢測血清的中和抗體時，需用已知蝕斑滴定度的參考毒株與待檢血清反應，蝕斑數減少表示血清有中和活性，中和反應後能引起50％蝕斑減少的血清稀釋度的倒數即爲蝕斑減少中和抗體的滴度。蝕斑減少中和試驗檢測基孔肯雅病毒中和抗體實驗應在BSL-3級實驗室內進行。
7.3.2 A.3.2 材料和試劑
材料和試劑如下：
a) 設備：4℃冰箱、37℃水浴鍋、二氧化碳培養箱、無菌平底 6 孔組織培養板。
c) 細胞生長液：100 mL 生長液中包含 Eagle's MEM 溶液 88mL，10 000IU/mL 青鏈黴素溶液 1 mL，1％谷氨醯胺 1 mL，胎牛血清 10 mL，用 7.5％碳酸氫鈉溶液調至 pH 7.2，用前混勻。
d) 細胞維持液：100 mL 維持液中包含 Eagle's MEM 溶液 96 mL，10 000 U/mL 青鏈黴素溶液 1 mL，1％谷氨醯胺 1 mL，胎牛血清 2 mL，用 7.5％碳酸氫鈉溶液調至 pH 7.2，用前混勻。
e) 細胞消化液：2.5 g 胰酶溶於 1 000 mL 無鈣鎂磷酸鹽緩衝液中，過濾除菌。
f) 病毒儲備液及其滴定：CHIKV 接種 Vero 細胞，待細胞出現細胞病理性效應（CPE）達+++後收穫病毒，離心後將上清分裝到無菌 2 mL 螺口血清管，凍存到-70℃冰箱作爲病毒儲備液備用。使用前先取一支病毒液進行病毒蝕斑形成單位（PFU）滴定。具體操作步驟爲：
1) 準備 3 塊已長成單層的 VERO 細胞 6 孔細胞培養板，並編號；
2) 將病毒液用維持液做連續 10 倍稀釋至 10-8，棄去細胞培養液，然後從最高稀釋度起將各稀釋度的病毒液加到 6 孔細胞板中，每個稀釋度加兩孔，每孔 0.1 mL，最後兩孔作細胞對照，37℃吸附 1 h；
3) 準備 1％瓊脂培養基，並使其保溫在 43℃，病毒吸附結束後加入瓊脂培養基到各細胞孔，每孔 3 mL，輕柔搖晃混勻，確保瓊脂將病毒液完全覆蓋，大約 20 min 後，瓊脂完全凝固，將平板倒置放入 CO2培養箱中，37℃培養；
4) 每天觀察計數蝕斑量，並在細胞板的背面用記號筆圈出蝕斑；如果接種 10-4稀釋度的病毒孔的蝕斑無法計數，接種 10-5稀釋度病毒的兩個細胞孔中平均有 100 個蝕斑，那麼病毒的滴度爲 10７PFU /mL。
g) 其他試劑：陽性對照血清、陰性對照血清、待測血清標本、牛血清白蛋白(BSA)、pH 7.4 的 Tris緩衝液、瓊脂糖、中性紅。
7.3.3 A.3.3 檢測方法
按以下步驟操作：
a) 待檢血清在 56℃水浴滅活 30 min，除去血清中的補體和其他干擾因子。
b) 用含 1％ BSA 的維持液稀釋病毒至每 0.1 mL 含有 200 個蝕斑單位（200 PFU/0.1 mL）。
c) 用含 1％ BSA 的維持液將待檢血清先做 1∶5 稀釋，然後做連續 2 倍稀釋至 1∶160 或是所需要的滴度，並保證每個稀釋度的工作容量爲 0.1 mL。
d) 取稀釋好的 200 PFU/0.1 mL 的病毒液 0.1 mL，分別加入 0.1 mL 不同稀釋度的血清中，混勻後，4℃孵育過夜，或者 37℃孵育 1h。
e) 取稀釋好的 200 PFU/0.1 mL 的病毒液 0.5 mL，加入等量的含 1％ BSA 的維持液混勻，然後對病毒液做連續 10 倍稀釋，包括：10-1和 10-2，這些混合稀釋液各自的最終病毒含量要達到 100PFU/0.1 mL、10 PFU/0.1 mL 和 1PFU/0.1 mL，最後對病毒液做回滴，並且病毒回滴液和病毒血清混合液在同樣條件下孵育。
f) 孵育結束後，先將 6 孔板中的單層細胞培養液吸出，然後加入病毒-血清混合液，每孔 0.1 mL。用另外一塊細胞培養板加入用於病毒回滴的病毒稀釋液，各稀釋度加兩孔，37℃吸附 1 h。
g) 準備含中性紅的 1％瓊脂或瓊脂糖培養基，加熱使其完全溶解後放置 43℃水浴使其保持液體狀態備用，含有中性紅染料的營養瓊脂配方爲：維持液中加 1％瓊脂和 0.4％中性紅。
h) 將上述 1％瓊脂培養基逐一加入病毒血清反應孔和病毒回滴孔中，每孔加入 3 mL，輕柔搖晃混勻，確保瓊脂將病毒-血清混合液完全覆蓋。
i) 大約 20 min 後，瓊脂完全凝固，將平板倒置放入 CO2培養箱中，37℃培養。每天觀察計數蝕斑量，並在倒置的平板上用記號筆圈出蝕斑。
7.3.4 A.3.4 結果判斷
結果判斷規則如下：
a) 病毒回滴試驗是爲了確定加入的病毒量是否合適，計算病毒回滴試驗中的蝕斑數，計算平行孔中的蝕斑數平均值，只有蝕斑量在 30～100 之間時才計算試驗孔中的蝕斑量，最後計算中和抗體滴度。
b) 陽性血清對照成立，測定抗體滴度在已知抗體滴度的上下一個稀釋度範圍內；同時檢測細胞對照孔，對照孔細胞形態正常則所做試驗結果可靠。只有試驗孔出現 90％的蝕斑量減少現象纔可判定出現了免疫中和反應。比如，逆滴定表明已知攻擊病毒滴度爲 100 PFU/0.1 mL，那麼≤10 個蝕斑量的血清稀釋度就是終點。
c) 能中和病毒的最高血清稀釋度的倒數就是蝕斑減少中和抗體滴度。
7.3.5 A.3.5 意義
8 附錄B（規範性附錄）基孔肯雅熱病原學檢測方法
8.1 B.1 基孔肯雅病毒分離與鑑定（細胞培養）
8.1.1 B.1.1 原理
基孔肯雅病毒（chikungunya virus，以下簡稱CHIKV）可感染蚊源C6/36細胞以及非洲綠猴腎細胞（Vero）和金黃地鼠腎細胞（BHK21）等哺乳動物細胞，並引起細胞病變效應（CPE）。細胞培養分離物可用特異性免疫熒光試驗或特異性核酸擴增試驗鑑定是否存在CHIKV。
8.1.2 B.1.2 材料和試劑
材料和試劑如下：
b) 易感細胞：C6/36 或 Vero 或 BHK21；
c) 細胞消化液：2.5 g 胰酶溶於 1 000 mL 無鈣鎂磷酸鹽緩衝液中，過濾除菌；
d) 細胞生長液：100 mL 生長液中包含 Eagle's MEM 溶液 88 mL，10 000 IU/mL 青鏈黴素溶液 1 mL，1％谷氨醯胺 1 mL，胎牛血清 10 mL，用 7.5％碳酸氫鈉溶液調至 pH 7.2，用前混勻；
e) 細胞維持液：100 mL 維持液中包含 Eagle's MEM 溶液 96 mL，10 000 U/mL 青鏈黴素溶液 1 mL，1％谷氨醯胺 1 mL，胎牛血清 2 mL，用 7.5％碳酸氫鈉溶液調至 pH 7.2，用前混勻。
8.1.3 B.1.3 檢測方法（以Vero細胞爲例）
按以下步驟操作：
a) 生長至單層的細胞管，棄去培養液，加入 200 µL 稀釋好的血清標本液，每份血清標本用細胞維持液作 1∶10、1∶100 稀釋，每個稀釋度接種兩管，置 5％CO2的培養箱中 37℃吸附 1 h（C6/36細胞爲 28℃吸附 1 h）；
b) 吸附 1 h 後吸出細胞管中的標本液，加入 1 mL 細胞維持液，同時設正常細胞對照，置 5％CO2培養箱中 37℃（C6/36 細胞爲 28℃）培養 7 d，每天觀察是否出現 CPE；如果 7 d 後仍未出現CPE，則需再盲傳 3 代。
8.1.4 B.1.4 結果判斷
CHIKV感染Vero細胞可出現典型的CPE，表現爲細胞脫落、壞死、破碎等特徵。但確定病毒分離成功需經病毒特異性RT-PCR或間接免疫熒光試驗對分離物或病變細胞進行鑑定。
8.1.5 B.1.5 意義
8.2 B.2 基孔肯雅病毒核酸檢測
8.2.1 B.2.1 TaqMan探針實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應（Real-time RT-PCR）
8.2.1.1 B.2.1.1 原理
病毒RNA在逆轉錄酶的作用下產生cDNA，可作爲聚合酶鏈（PCR）擴增反應的模版。TaqMan探針實時熒光定量PCR時，在反應體系中加入一對病毒特異性引物和一條熒光基團標記的病毒特異性探針。TaqMan探針的兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團，在探針完好的情況下，報告基團發出的熒光信號被淬滅基團所吸收，因而檢測不到熒光信號。在PCR擴增過程中，探針和引物與目標序列結合，當新生鏈沿着cDNA模板延伸到熒光標記的探針結合位點時，Taq酶發揮5′→3′核酸外切酶的功能，熒光報告基團與淬滅基團分離，熒光基團釋放熒光信號。這樣模板每擴增一次，就產生一個遊離的熒光分子，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板可進行定量分析。其中RNA逆轉錄過程可以和PCR擴增反應同時進行也可先進行逆轉錄反應再進行PCR擴增。其他類似機制的熒光探針也可用於核酸檢測。
8.2.1.2 B.2.1.2 材料和試劑
材料和試劑如下：
a) 設備：移液器（1 mL、200 µL、100 µL、20 µL、10 µL 和 2 µL）及配套吸頭；離心管(1.5 mL、0.2 mL 和 0.1 mL)；試管架（5 mL、1.5 mL 和 20 µL ）；高速冷凍離心機；旋渦混合器；熒光定量 PCR 儀等；
b) 試劑：病毒核酸提取試劑盒；熒光定量 RT-PCR 試劑盒；引物及探針等（參考序列如下）：
CHIKV-FP：5′-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3′
CHIKV-RP：5′-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3′
CHIKV-P：5′-FAM-TGCCCACACTGTGA–BHQ1-3′（帶下劃線的鹼基需要 LNA 修飾）。
8.2.1.3 B.2.1.3 檢測方法
按以下步驟操作：
a) 病毒 RNA 提取：待檢標本用病毒 RNA 提取試劑盒提取，操作步驟按介紹進行，製備的病毒核酸作爲 Real-time RT-PCR 的模板。
b) Real-time RT-PCR 擴增：一步法 Real-time RT-PCR 檢測反應條件爲：42℃ 15 min，95℃ 2 min，95℃ 10 s，62℃ 30 s，45 個循環，儀器設置在每一循環 62℃退火/延伸步驟讀取熒光信號。該反應條件可根據採用的試劑要求進行適當的調整。
8.2.1.4 B.2.1.4 結果判斷
結果判斷規則如下：
a) 以熒光 PCR 反應的前 3～15 個循環的熒光信號作爲熒光本底信號，以本底信號標準差的 10 倍作爲熒光閾值，標本擴增產生的熒光信號達到熒光閾值時所對應的循環數爲循環閾值（Ct 值）。
b) 檢測樣品的 Ct 值≤35.0，且出現典型的擴增曲線，可報告樣品特異性核酸檢測陽性。檢測樣品的 Ct 值介於 35～45 之間時，屬臨界區間，建議重複檢測。若重複檢測結果 Ct 值≥45.0 者爲陰性；若 Ct 值仍介於 35～45 之間，且擴增曲線有明顯的指數增長特徵者，可報告樣品特異性核酸檢測陽性。
c) 陽性對照的 Ct 值應≤32.0，並出現典型的“S”型擴增曲線；陰性對照 Ct 值應≥45；否則視爲實驗結果無效，需重複檢測。
8.2.1.5 B.2.1.5 意義
病人血清中檢測到CHIKV核酸表示病人體內存在CHIKV，可作爲病例確診的依據。
8.2.2 B.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）
8.2.2.1 B.2.2.1 原理
病毒RNA在逆轉錄酶的作用下先轉錄成模板cDNA，然後在聚合酶的作用下合成特異DNA片段，擴增主要由變性、退火和延伸三個步驟反覆循環構成：即在高溫（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成爲兩條單鏈DNA模板；而後在低溫（37℃～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在適宜溫度下（72℃）經Taq酶催化，以引物3′端爲合成的起點，以單核苷酸爲原料，沿模板以5′→3′方向延伸，合成新的DNA鏈。
8.2.2.2 B.2.2.2 材料和試劑
材料和試劑如下：
a) 設備：移液器（1 mL、200 µL、100 µL、20 µL、10 µL 和 2 µL）及配套吸頭；離心管(1.5 mL、0.2 mL 和 0.1 mL)；試管架（5 mL、1.5 mL 和 20 µL ）；高速冷凍離心機；旋渦混合器；恆溫振盪器；PCR 儀等；
b) 試劑：CHIKV 特異性引物（CHIKV-F，CHIKV-R）；RNA 提取試劑；一步法 RT-PCR 檢測試劑；CHIKV-F:5′-GGGCGGGTAGTCCATGTTGTAGA-3′；CHIKV-R: 5′-ACCGGCGTCTACCCATTCATGT-3′。
8.2.2.3 B.2.2.3 檢測方法
按以下步驟操作：
a) 病毒 RNA 提取：待檢標本用病毒 RNA 提取試劑盒提取，操作步驟按介紹進行，製備的病毒核酸作爲 RT-PCR 的模板。
b) 一步法 RT-PCR 擴增：反應條件爲：逆轉錄 50℃ 30 min；PCR 反應，94℃ 2 min 一次，再進行 35 個循環的 94℃ 30 s，57℃ 30 s，68℃ 40 s，最後再以 68℃ 5 min 結束。該反應條件可根據不同的試劑進行適當的調整。
8.2.2.4 B.2.2.4 結果判斷
RT-PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果條帶的分子量與預期片段大小（330 bp）相同，可判定CHIKV核酸擴增陽性。
8.2.2.5 B.2.2.5 意義
9 附錄C（資料性附錄）基孔肯雅熱的鑑別診斷
9.1 C.1 登革熱
基孔肯雅熱與登革熱的傳播媒介相同，流行區域基本相同，臨牀表現亦類似，與登革熱較難鑑別，兩種疾病可同時發生於同一人。與基孔肯雅熱相比，登革熱發熱持續時間更長，肌肉痛更明顯，無明顯遊走性及多發性關節疼痛或關節炎表現，有出血傾向，白細胞和血小板減少明顯。兩者的鑑別需要依賴實驗室特異性檢測。
9.2 C.2 甲病毒（Alphavirus）感染
指阿尼昂尼昂病毒（O’nyongnyongvirus）、馬雅羅病毒（Mayaro virus）、羅斯河病毒（Ross river viurus）等感染疾病的統稱。
阿尼昂尼昂病毒病以低熱爲主，多關節炎呈對稱性分佈，有頸部淋巴結腫大。馬雅羅病毒病的關節炎或關節痛通常會持續2個月，有發熱、頭痛、皮疹和淋巴結病。羅斯河病毒病又稱流行性多關節炎，爲非對稱性遊走性關節炎，低熱爲主。
上述甲病毒感染抗原性比較接近，引起的臨牀表現和基孔肯雅熱均相似，一般的血清學方法難以區別，需用交叉中和試驗或單克隆抗體來鑑別。核酸檢測和病毒分離是鑑別這些病毒感染的主要方法。
9.3 C.3 傳染性紅斑
由細小病毒B19引起，首先出現顴部紅斑，伴口周蒼白，2 d～5 d後出現軀幹和四肢的斑丘疹。關節受損表現爲多發性關節炎，較多發生在近端指/趾關節、掌關節，可侵犯腕、膝和踝關節。鑑別方法爲細小病毒B19特異性抗體和核酸檢測陽性。
9.4 C.4 感染後關節炎（包括風溼熱）
表現爲一處或多處關節炎，主要累及大關節，起因爲感染衣原體、志賀氏菌、淋病等。風溼熱更常發生於兒童，多見遊走性多關節炎，常累及大關節。鑑別需要查看抗鏈球菌溶血素（ASO）滴度和咽痛史。
9.5 C.5 猩紅熱
發熱，咽痛明顯，1 d～2 d後全身出現針尖大小紅色丘疹，爲粟粒樣皮疹，疹間皮膚充血，壓之褪色，皮疹消退後多出現大片脫屑。外周血白細胞及中性粒細胞增高顯著。少數患者病後可出現變態反應性關節損害。
9.6 C.6 立克次體病（斑疹傷寒、恙蟲病）
斑疹傷寒多見於冬春季節及寒冷地區，有蝨寄生或叮咬史，發熱伴有寒戰、乏力、劇烈頭痛等全身毒血症狀，皮疹多於病程第4天～第5天出現，多孤立存在，不融合。外斐試驗（變形桿菌OX19凝集試驗）陽性。一般無關節痛症狀。
恙蟲病是人被帶有病原體的恙蟎幼蟲叮咬而得病。發熱伴有寒戰、乏力、劇烈頭痛等全身毒血症狀，可有皮疹、淺表淋巴結腫大，焦痂或特異性潰瘍最具臨牀診斷價值。外斐試驗（變形桿菌OXk凝集試驗）陽性。一般無關節痛症狀。
9.7 C.7 麻疹
典型麻疹前驅期主要爲發熱伴有上呼吸道卡他症狀、結膜充血、畏光、口腔麻疹黏膜斑。典型的皮疹及出疹順序，麻疹的血清特異性IgM抗體陽性。一般無關節痛症狀。
9.8 C.8 藥疹
多於近期有服藥史，皮疹多伴瘙癢，爲多形性皮疹，停藥後、使用抗過敏藥物治療皮疹可消退。 血中嗜酸性粒細胞可增多。一般無關節痛症狀。
10 附錄D（資料性附錄）基孔肯雅熱流行病學及臨牀表現
10.1 D.1 流行病學
10.1.1 D.1.1 傳染源
人和非人靈長類動物是CHIKV的主要宿主。急性期患者、隱性感染者和感染病毒的非人靈長類動物是本病的主要傳染源。
人患該病時，在出現症狀後1 d～5 d內可產生高滴度病毒血癥，因此急性期患者有較強的傳染性。流行期間，隱性感染者也是重要的傳染源。在叢林型疫源地內，非人靈長類動物爲本病的主要傳染源，已證實非洲綠猴、狒狒、紅尾猴、黑猩猩、長臂猿、獼猴和蝙蝠可自然或實驗感染CHIKV，並能產生病毒血癥。
10.1.2 D.1.2 傳播途徑
主要通過感染病毒的伊蚊叮咬而傳播。實驗室內可能通過氣溶膠傳播，目前尚無直接人傳人的報道。
雌性伊蚊叮咬病毒血癥期的人後感染上CHIKV，病毒在蚊唾液腺細胞內大量增殖，經2 d～10 d的外潛伏期後，隨着再次吸血，將病毒傳播給易感者。
10.1.3 D.1.3 傳播媒介
埃及伊蚊和白紋伊蚊是本病的主要傳播媒介。埃及伊蚊與白紋伊蚊主要孳生在室內或房屋周邊較爲潔淨的容器積水中，一般在白天叮咬人，活動高峯在日出後2 h和日落前2 h。病毒在蚊體內存活時間較長，甚至終生具有傳染性。
10.1.4 D.1.4 潛伏期
1 d～12 d（通常3 d～7 d）。
10.1.5 D.1.5 傳染期
患者在出現症狀後1 d～5 d內可產生高滴度病毒血癥，可引起媒介伊蚊的感染從而傳播該病。
10.1.6 D.1.6 易感性和免疫力
未曾暴露於CHIKV的人羣普遍易感。一般認爲，人感染CHIKV後，可產生持久免疫力，不會再次感染。
10.1.7 D.1.7 地理分佈
基孔肯雅熱的地理分佈與媒介伊蚊的地理分佈相關，目前亞洲、非洲、歐洲以及美洲有百餘個國家和地區已確認有基孔肯雅熱疫情發生。
近年來非洲、美洲地區、亞洲地區常發生基孔肯雅熱的暴發和流行。自2005年起，該病在印度洋各羣島大範圍流行，印度、印度尼西亞、馬爾代夫、緬甸和泰國報告病例超過190萬例。印度2006—2007年的大規模流行報告疑似病例超過139萬，部分地區的發病率超過45％；法屬留尼旺島的發病數高達27萬人，約佔當地人口的40％。2007年歐洲的意大利東北部首次報告了一次局部暴發。2008—2009年，泰國、新加坡、印度、馬來西亞繼續報告基孔肯雅熱疫情。2010年中國廣東東莞報告國內首宗輸入病例引發的本地基孔肯雅熱暴發。
2013年12月，法國報告了法屬聖馬丁島兩例經實驗室確診的本地基孔肯雅熱病例。此後，在美洲區域超過43個國家和地區確認發生了本地傳播，截至2015年4月，加勒比島嶼、拉丁美洲國家和美國已記錄的基孔肯雅熱疑似病例近138萬。美洲地區的國家通報了近70萬例基孔肯雅熱疑似病例和3.7萬例確診病例，其中哥倫比亞出現35.6萬疑似病例。2016年，美洲地區國家報告近35萬疑似病例和14.7萬例確診病例，報告病例數最多的國家是巴西（26.5萬例），玻利維亞和哥倫比亞阿根廷發病較多。非洲的肯尼亞報告了一起1 700多例疑似病例的疫情。2016年至2017年，巴基斯坦發生基孔肯雅熱的暴發。
10.1.8 D.1.8 發病季節特點
發病季節與當地的媒介伊蚊季節消長有關。在熱帶和亞熱帶地區，基孔肯雅熱一年四季均可發病，發病高峯一般在8月份～10月份。
10.2 D.2 臨牀表現
10.2.1 D.2.1 急性期
10.2.1.1 D.2.1.1 發熱
急性起病，寒戰、發熱，體溫可達39℃，熱程通常1 d～7 d，可自行退熱；部分病人熱退後再次出現發熱，表現爲雙峯熱，持續3 d～5 d恢復正常。
10.2.1.2 D.2.1.2 關節疼痛
發熱時，多個關節出現疼痛和腫脹，關節痛多爲對稱性，且進展迅速，可數分鐘或數小時內關節功能喪失。多侵犯小關節如指、趾、腕、踝關節等，也可累及膝、肩等大關節，可持續數天或數月。
10.2.1.3 D.2.1.3 皮疹
半數以上病例會在發熱後2 d～5 d出現皮疹,皮疹呈典型的斑疹、丘疹或紫癜，主要分佈在軀幹、四肢的伸側、手掌和足底，疹間皮膚多爲正常，可伴瘙癢感。數天後消退。
10.2.1.4 D.2.1.4 其他
急性期可出現肌肉痛、彌散性後背痛、頭痛、噁心、嘔吐、食慾減退、淋巴結腫大等症狀和體徵。少數患者可有結膜充血、輕度畏光的結膜炎表現，可出現腦膜炎、肝腎功能異常、心肌炎及皮膚黏膜出血等。基孔肯雅熱引起的死亡病例極爲罕見。
10.2.2 D.2.2 亞急性和慢性期
出現症狀10 d後，大多患者會感覺好轉，關節痛減輕。但有部分病人會隨後出現風溼病症狀，包括末梢多發性關節炎、發病初期受累關節和骨骼疼痛再次加劇、腕和踝關節亞急性增殖性腱鞘炎。部分病人還可發展成短暫性外周血功能障礙，如Raynaud’s綜合徵。
慢性期多指病症持續到3個月以上，最常見的慢性期症狀是急性期受累的關節出現持續性炎性關節痛，但受累部位X線和實驗室檢查通常無陽性發現。然而，部分患者進而可發展爲破壞性的關節炎或關節痛，類似類風溼或銀屑病性關節炎。
其他慢性症狀還有疲倦和抑鬱等。
10.3 D.3 高危人羣
高齡和新生兒患者、既往關節功能障礙、急性期症狀嚴重、有基礎疾病者是不良預後的高危因素。
10.4 D.4 實驗室檢查及治療
白細胞計數多數爲正常，少數病例白細胞總數及淋巴細胞減少，血小板正常或輕度降低。血清學檢測及病原學檢測（見附錄A和附錄B）。
本病目前尚無疫苗及特效抗病毒治療藥物，主要採取對症支持治療。高熱病人採用物理降溫，避免使用阿司匹林。關節劇烈疼痛者可使用抗炎鎮痛藥物如布洛芬、奈普生、對乙酰氨基酚等。腦膜腦炎治療主要爲預防腦水腫，可使用甘露醇、速尿等藥物降低顱內壓等。
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