3 基本信息
ICS 11.020
C 59
中華人民共和國衛生行業標準WS 588—2018《手足口病診斷》（Diagnosis for hand, foot and mouth disease）由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會2018年3月6日《關於發佈〈丙型肝炎診斷〉等7項衛生行業標準的通告》（國衛通〔2018〕4號）發佈。本標準自2018年8月1日起施行。
4 發佈通知
關於發佈《丙型肝炎診斷》等7項衛生行業標準的通告
國衛通〔2018〕4號
現發佈《丙型肝炎診斷》等7項衛生行業標準，編號和名稱如下：
一、強制性衛生行業標準
WS 213—2018 丙型肝炎診斷（代替WS 213—2008 ）
WS 216—2018 登革熱診斷（代替WS 216—2008 ）
WS 273—2018 梅毒診斷（代替WS 273—2007 ）
WS 291—2018 麻風病診斷（代替WS 291—2008）
二、推薦性衛生行業標準
WS/T 590—2018 基孔肯雅熱診斷
上述標準自2018年8月1日起施行,WS 213—2008 、WS 216—2008、WS 273—2007、WS 291—2008 同時廢止。
特此通告。
國家衛生計生委
2018年3月6日
5 前言
本標準第6章爲強制性條款，其餘爲推薦性條款。
本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。
本標準起草單位：首都醫科大學附屬北京地壇醫院、中國疾病預防控制中心、首都醫科大學附屬北京兒童醫院、中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所。
本標準主要起草人：李興旺、楊維中、王子軍、錢素雲、陳志海、許文波、張靜、盧聯合。
6 標準正文
手足口病診斷
6.1 1 範圍
本標準適用於全國各級各類醫療衛生機構及其醫務人員對手足口病的診斷。
6.2 2 術語和定義
下列術語和定義適用於本文件。
6.2.1 2.1 手足口病 hand,foot and mouth disease
由人腸道病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型（CV-A16）等腸道病毒引起的急性傳染病，多見於學齡前兒童。重症病例多由EV-A71感染所致。
6.3 3 縮略語
下列縮略語適用於本文件。
CPE：細胞病變效應（cytopathic effect）
CV-A16：柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus A16）
cDNA：互補DNA
dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate）
EDTA:乙二胺四乙酸
ELISA：酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay）
EV-A71:人腸道病毒71型（human enterovirus A71）
IgG：免疫球蛋白 G（immunoglobulin G）
IgM：免疫球蛋白M（immunoglobulin M）
MEM：Eagle’s 培養液（eagle’s minimum essential medium）
OPD：鄰苯二胺
RT-PCR：逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction）
TMB：3,3’,5,5'-四甲基聯苯胺
Vero：非洲綠猴腎細胞
6.4 4 診斷依據
6.4.1 4.1 流行病學特點
一年四季均可發病，具有季節性分佈特點，南方可出現春夏季主高峯和秋冬季次高峯，北方主要出現夏秋流行，尤其是夏季。腸道病毒傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑複雜、傳播速度快，在短時間內可造成較大範圍的流行，流行期間，可在幼兒園、托幼機構、家庭等地出現聚集性或暴發疫情。
6.4.2 4.2 臨牀表現
潛伏期一般爲2 d～10 d，平均3 d～5 d。
急性起病，發熱，手、足和臀部出現斑丘疹、皰疹，口腔黏膜或咽峽部出現散在皰疹。可伴有咳嗽、流涕、食慾不振、腹瀉等症狀。
部分病例僅表現爲手、足和臀部皮疹和/或咽峽部皰疹。少數病例皮疹不典型，表現爲細小沙粒狀皮疹、單部位皮疹或無皮疹。
少數病例可累及中樞神經系統，表現爲腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎，甚至出現肺水腫、肺出血和/或循環功能障礙等，病情進展迅速，可致死亡。
6.4.3 4.3 實驗室檢查
6.4.3.1 4.3.1 一般檢查
6.4.3.1.1 4.3.1.1 血常規
6.4.3.1.2 4.3.1.2 血糖
危重型病例可升高。
6.4.3.1.3 4.3.1.3 腦脊液
中樞神經系統受累時常表現爲：外觀清亮，壓力增高，白細胞計數增多，多以單核細胞爲主，蛋白正常或輕度增多，糖和氯化物正常。
6.4.3.2 4.3.2 血清學及病原學檢查
4.3.2.1 用 ELISA 等方法在患者血清或腦脊液中檢測到抗 EV-A71 或 CV-A16 等腸道病毒 IgM 抗體（見附錄 A）。
4.3.2.2 用 ELISA 或中和試驗等方法檢測患者血清中 EV-A71 或 CV-A16 等腸道病毒 IgG 抗體，恢復期血清比急性期有≥4 倍升高或急性期抗體陰性而恢復期抗體陽轉。
4.3.2.3 用 RT-PCR、熒光定量 RT-PCR 等方法從患者鼻咽拭子、肛拭子、糞便、皰疹液、腦脊液或屍檢標本中檢測到 EV-A71 或 CV-A16 等腸道病毒特異性核酸（見附錄 B）。
4.3.2.4 用 RD、HEp-2 或 Vero 等細胞系對患者鼻咽拭子、肛拭子、糞便、皰疹液、腦脊液或屍檢標本進行病毒培養，可分離到 EV-A71 或 CV-A16 等腸道病毒（見附錄 C）。
6.5 5 診斷原則
5.1 根據臨牀表現及一般實驗室檢查結果可做出臨牀診斷和分型。流行病學資料可作爲參考。
6.6 6 診斷
6.6.1 6.1 臨牀診斷病例
符合4.2，並排除其他相關疾病。
6.6.2 6.2 確診病例
臨牀診斷病例，並具有4.3.2之一者。
6.6.3 6.3 臨牀分型
6.6.3.1 6.3.1 普通型
6.6.3.2 6.3.2 重型
出現中樞神經系統受累表現，如：精神差、嗜睡、易驚、譫妄；頭痛、嘔吐；肢體抖動、肌陣攣、眼球震顫、共濟失調、眼球運動障礙；無力或急性弛緩性麻痹；驚厥。可見腦膜刺激徵，腱反射減弱或消失。實驗室檢查可有白細胞和血糖升高。
6.6.3.3 6.3.3 危重型
重型病例出現下列情況之一者：
c) 皮膚花斑、四肢冰涼、心率明顯加快、血壓明顯上升或下降等循環功能障礙表現。
6.7 7 鑑別診斷
6.7.1 7.1 其他出疹性疾病
手足口病普通型應與丘疹性蕁麻疹、水痘、不典型麻疹、幼兒急疹、帶狀皰疹以及風疹等疾病鑑別。可根據流行病學、皮疹形態、部位、出疹時間及順序、有無淋巴結腫大以及伴隨症狀等進行鑑別，以皮疹的形態及部位最爲重要。最終可依據病原學和血清學檢測結果進行鑑別。
6.7.2 7.2 其他病毒所致腦膜炎或腦炎
由其他病毒引起的腦膜炎或腦炎，如單純皰疹病毒、鉅細胞病毒、EB病毒、流行性乙型腦炎病毒等，臨牀表現與手足口病出現的中樞神經系統損害表現相近。對皮疹不典型者，根據流行病學史、病原學或血清學檢查結果做出診斷。
6.7.3 7.3 脊髓灰質炎
手足口病出現急性弛緩性麻痹（AFP）時應與脊髓灰質炎鑑別。後者主要表現爲雙峯熱，病程第2周退熱前或退熱過程中出現弛緩性麻痹，且無皮疹。最終依據病原學檢測結果鑑別。
6.7.4 7.4 肺炎
手足口病危重型病例可發生肺水腫，應與肺炎鑑別。肺炎主要表現爲發熱、咳嗽、呼吸急促等呼吸道症狀，一般無皮疹；病情進展相對緩慢，胸片加重或減輕均呈逐漸演變，可見肺實變病竈、肺不張及胸腔積液等。
7 附錄A（規範性附錄）手足口病相關腸道病毒特異性抗體檢測
7.1 A.1 ELISA檢測EV-A71 IgM抗體
7.1.1 A.1.1 試驗材料
試驗材料如下：
a) 微孔板：包被抗人 IgM；
h) 底物：TMB 或 OPD；
i) 終止液：含硫酸，濃度 2 mol/L。
7.1.2 A.1.2 標本
標本如下：
a) 血清或血漿，含或不含 EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的標本。無懸浮纖維蛋白或聚合物、重度溶血、細菌污染。
b) 腦脊液。
7.1.3 A.1.3 步驟
因不同試劑盒操作方法及流程不同，具體操作按照其試劑介紹進行，本文以ELISA通用操作爲例，檢測步驟如下：
a) 試劑室溫平衡 30 min 以上；
c) 編號：將標本對應微孔板按序編號，每板應設陰性對照 3 孔，陽性對照 2 孔和空白對照 1 孔；
d) 加稀釋液：每孔加入標本稀釋液 100 µL，空白孔除外；
e) 加樣：分別在相應孔中加入待測標本或陰性、陽性對照 10 µL，輕輕振盪混勻（腦脊液可以1︰2 稀釋）；
f) 孵育：用封板膜封板後，37℃孵育 30 min；
g) 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌 5 遍，最後一次扣幹；
i) 加酶：每孔加入酶標試劑 50 µL，空白孔除外，輕輕振盪混勻；
j) 孵育：用封板膜封板後，37℃孵育 30 min；
k) 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌 5 遍，最後一次扣幹；
l) 顯色：每孔加入顯色劑 A、B 液各 50 µL，輕輕振盪混勻，37℃避光顯色 15 min；
m) 測定：每孔加入終止液 50 µL，輕輕振盪混勻，10 min 內測定結果，設定酶標儀波長於 450 nm，用空白孔調零後測定各孔 OD 值。
7.1.4 A.1.4 試劑對照範圍
A.1.4.1 陰性對照OD值≤0.1。若1孔陰性對照OD值>0.1應捨棄，若2孔或3孔陰性對照OD值>0.1，應重複試驗。
A.1.4.2 陽性對照OD值≥0.8。
7.1.5 A.1.5 結果判斷
A.1.5.1 臨界值（cutoff）計算：臨界值=0.1+陰性對照OD均值。（陰性對照孔OD值低於0.05按0.05計算）。
A.1.5.2 陰性判定：標本OD值＜臨界值，爲EV-A71 IgM抗體陰性。
A.1.5.3 陽性判定：標本OD值≥臨界值，爲EV-A71 IgM抗體陽性。
7.2 A.2 手足口病腸道病毒中和抗體檢測
7.2.1 A.2.1 液體配製
7.2.1.1 A.2.1.1 血清處理液(A液)
100 mL中含下列液體：
a) MEM，85 mL；
b) 3％ L-谷氨醯胺，1 mL；
c) 7.5％碳酸氫鈉，2 mL；
d) 胎牛血清，2 mL；
e) 青、鏈黴素（各 10 000 U/mL），10 mL。
7.2.1.2 A.2.1.2 細胞營養液（B液）
按生長液配方配製，100 mL中含下列液體：
a) MEM，85 mL；
b) 3％ L-谷氨醯胺，1 mL；
c) 7.5％碳酸氫鈉，2 mL；
d) HEPES，1 mL；
e) 胎牛血清，10 mL；
f) 青黴素、鏈黴素（各 10 000 U/mL），1 mL。
7.2.1.3 A.2.1.3 病毒（血清）稀釋液（C液）
按維持液配方配製，100 mL中含下列液體：
a) MEM，93 mL；
b) 3％ L-谷氨醯胺，1 mL；
c) 7.5％碳酸氫鈉，2 mL；
d) HEPES，1 mL；
e) 胎牛血清，2 mL；
f) 青黴素、鏈黴素（各 10 000 U/mL），1 mL。
7.2.2 A.2.2 攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度製備（EV-A71或CV-A16）
A.2.2.1 將增殖後的病毒懸液凍融3次，然後在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液分裝於 20支凍存管中，每管0.5 mL，保存在－70℃冰箱長期保存。每次中和試驗取一管，每管應在一次試驗中用完，有剩餘者應滅活後廢棄。
A.2.2.2 加Eagle液10倍系列稀釋爲10-8～10-1病毒液，各加入細胞板內，每孔50μL，每稀釋度4孔細胞。
A.2.2.3 每孔加細胞懸液50μL，同時設細胞對照（50μL稀釋液+50μL細胞懸液）， 36℃培養7 d，觀察細胞病變。
A.2.2.4 按Behrens-Kärber公式計算出分離病毒株的CCID50。
A.2.2.5 正式試驗前應先滴定攻擊病毒2次～3次，取其平均值，求出每0.05 mL中含100 CCID50的病毒載量。
A.2.2.6 按照計算好的稀釋比例配製攻擊病毒，求出試驗所需的病毒總量（即100 CCID50/0.05 mL）。
A.2.2.7 取3支小試管，每支加病毒稀釋液（液體配製中的C液）0.9 mL。
A.2.2.8 用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1 mL已經稀釋好的攻擊病毒液（即100 CCID50/0.05 mL）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕並徹底地混勻，避免產生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至0.1 CCID50/0.05 mL。
7.2.3 A.2.3 稀釋血清
A.2.3.1 發病1 d～7 d內採集的患者急性期血清，發病後3周～4周採集的恢復期血清，分別-20℃凍存備檢。
A.2.3.2 取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（A.2.1.1液體配製中的A液）0.3 mL，加待測血清0.1 mL，蓋緊塞子，振搖混勻，放4℃冰箱過夜，即爲1:4稀釋血清。次日56℃、30 min滅活。
A.2.3.3 打開獨立無菌包裝48孔組織培養板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（A.2.1.3液體配製中的C液）0.3 mL，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取處理過的血清0.1 mL加入第一孔（即爲1:16），吹吸8次～10次，吸0.1 mL加入第二孔（即爲1:64），依次至1:1 024，血清稀釋的過程中不必換吸尖。即每份血清標本進行4倍倍比稀釋，即1:4、1:16、1:64、1:256、1:1 024。
7.2.4 A.2.4 病毒中和抗體測定的操作步驟
具體操作步驟如下：
a) 取一塊 96 孔板橫向使用，每塊板可以做 8 份（4 對）待測血清，版面設計見圖 A.1。
1) A1-A2 孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入 1:1 024稀釋度的待測血清 0.05 mL，不必換吸尖；
2) 在 A3-A4 孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入 1:256稀釋度的待測血清 0.05 mL；
3) A5-A6 孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入 1:64 稀釋度的待測血清 0.05 mL；
4) A7-A8 孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入 1:16 稀釋度的待測血清 0.05 mL；
5) A9-A10 孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4 稀釋度的待測血清 0.05 mL；
6) A11-A12 孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）爲每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液 0.05 mL。
b) 上述孔中分別加入病毒 0.05 mL（病毒滴度事先已經稀釋爲 100 CCID50/0.05 mL）。
c) 蓋好蓋子後用微量板混勻器混勻，放入 36℃ CO2孵箱中孵育 2 h。
d) 另取一塊 96 孔板縱向使用，做 100 CCID50/0.05 mL 病毒滴度的核實（每次實驗都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配製中的 C 液）0.05 mL，然後從 0.1 CCID50/0.05 mL 加起，每孔0.05 mL，每個稀釋度 8 孔，不必更換吸尖，一直加至 100 CCID50/0.05 mL；同時留出 4 孔做爲細胞對照孔，每孔加入 0.1 mL 病毒稀釋液，然後放入 4℃冰箱中暫存。
e) 在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液的濃度爲 2×105個/mL，每塊 96 孔板至少需要準備 10 mL。
f) 孵育結束後每個待測血清孔、血清對照孔（待檢標本板）和病毒回滴孔和細胞對照孔（病毒回滴板）分別加入 0.1 mL 細胞懸液，然後用微量板混勻器混勻，放入 36℃ CO2孵箱中孵育培養；
g) 使用倒置顯微鏡每天觀察 CPE，並記錄病毒滴定結果，以不產生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數爲終點效價。當 100 CCID50/0.05 mL 的病毒對照孔出現完全病變時，判定最終結果（5 d～7 d）。
h) 注意：如果病毒對照結果（病毒回滴）不在 32 CCID50/0.05 mL～320 CCID50/0.05 mL 的範圍內，實驗無效，就要重複實驗。
7.2.5 A.2.5 結果判定
A.2.5.1 當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現細胞病變，另一孔不出現細胞病變，該稀釋度的倒數計即爲該血清標本的中和抗體效價。
A.2.5.2 當高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數即爲該血清標本的中和抗體效價。
A.2.5.3 當兩個相鄰稀釋度血清均出現1孔細胞病變，另1孔不出現細胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數即爲該血清標本的中和抗體效價。
A.2.5.4 對於HFMD患者的雙份血清中和實驗結果來說，如果恢復期血清較急性期血清EV-A71或CV-A16中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高即可確診。
A.2.5.5 如恢復期血清較急性期血清其他腸道病毒中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否爲病因還應結合臨牀和流行病學判斷。
8 附錄B（規範性附錄）手足口病相關腸道病毒核酸檢測
8.1 B.1 RT-PCR法檢測腸道病毒核酸
8.1.1 B.1.1 試驗材料
B.1.1.1 可用於手足口病腸道病毒檢測的臨牀標本：鼻咽拭子、肛拭子、糞便、皰疹液、腦脊液或屍檢標本，或其病毒分離培養物。
B.1.1.2 擴增引物設計如下：
a) 人腸道病毒核酸檢測通用引物序列（產物長度 116bp）：PE2（上游）：5′- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3′；PE1（下游）：5′- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3′；
b) EV-A71 核酸檢測引物序列（產物長度 226bp）：EV-A71-S（上游）：5′- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3′；EV-A71-A（下游）：5′- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3′；
c) CV-A16 核酸檢測引物序列（產物長度 208bp）：CV-A16-S（上游）：5′-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3′；CV-A16-A（下游）；5′-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3′。
B.1.1.3 總RNA提取試劑：可使用商業化試劑盒提取RNA。
B.1.1.4 AMV逆轉錄酶、耐熱DNA聚合酶和dNTP等。
8.1.2 B.1.2 操作步驟：不同試劑盒RT-PCR操作及反應流程不同，具體操作以介紹爲準，本文以兩步法RT-PCR爲例。
B.1.2.1 總RNA提取：按試劑說明提取細胞總RNA，製備模板RNA。
B.1.2.2 設計對照，A：陽性對照：滅活病毒對照。B：正常細胞對照。C：試劑對照：用去離子水代替標本。
B.1.2.3 逆轉錄合成cDNA：根據AMV逆轉錄酶生產廠介紹，通過逆轉錄合成與目的基因RNA序列互補的cDNA
B.1.2.4 配置反應體系：不同試劑盒配置體系不同，本文以一般通用方法爲例。具體配置見表B.1。
表B.1 PCR反應體系配置（50 μL體系）
試劑名稱 | 體積 |
10×PCR Buffer | 5μL |
50 mM MgCl2 | 1.5μL |
10 mM dNTP Mix | 1μL |
上游引物(0.1μg/μL) | 1μL |
下游引物（0.1μg/μL） | 1μL |
Taq DNA聚合酶(5 U/μL) | 0.5 μL |
cDNA（逆轉錄產物） | 5μL |
RNase Free dH2O | 35 μL |
B.1.2.5 PCR擴增：PCR循環特異性擴增目的基因片度，反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共擴增30個～35個循環；最後72℃延伸10 min。
8.1.3 B.1.3 結果判斷
如果PCR擴增產物電泳條帶分子量與預期產物片段大小相同，表明爲陽性。標本的實驗室診斷結果根據表B.2進行判斷。
表 B.2 PCR 產物結果判斷參照表
實驗室診斷結果 | |
EV (-), EV-A71 (-), CV-A16 (-) | |
EV (+), EV-A71 (-), CV-A16 (-) | |
EV (+), EV-A71 (+), CV-A16 (-) | EV-A71 |
EV (+), EV-A71 (-), CV-A16 (+) | CV-A16 |
8.1.4 B.1.4 意義
8.2 B.2 熒光定量RT-PCR法檢測腸道病毒核酸
8.2.1 B.2.1 方法
單通道檢測EV-A71，單通道檢測CV-A16，單通道檢測腸道病毒；或採用雙通道同時檢測EV-A71和CV-A16；或採用三通道同時檢測EV-A71和CV-A16和腸道病毒。
8.2.2 B.2.2 試驗材料
B.2.2.2 擴增引物和熒光探針設計如下：
a) CAV16 熒光引物探針：上游引物：CAV16YGF：5′-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3’；下游引物：CAV16YGR：5′-CCCATCAARTCAATGTCCC-3′；探針（FAM 熒光素標記）：CAV16YGPB：5′-(FAM) – ACAATGCCCACCACGGGTACACA-(BHQ1)- 3′。
b) EV71 熒光引物探針：上游引物：EV71YGF：5′-TGATTGAGACACGCTGTGTTCTTA- 3′’；下游引物：EV71YGR: 5′- CCCGCYCTGCTGAAGAAACT- 3′；探針（HEX 熒光素標記）：EV71YGPB： 5′-HEX -TCGCACAGYACAGCTGAGACCACTC-- (TAMARA)- 3′。
c) 腸道病毒熒光引物探針：上游引物：EV(YG)F：5′-GGCTGCGYTGGCGGCC-3′；下游引物：EV(YG)R：
5′-CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3′；探針（FAM 熒光素標記）：EVTY(YG)PB：5′-(FAM)－ CTCCGGCCCCTGAATGCGG－(BHQ1)- 3′。
B.2.2.3 總RNA提取試劑：可使用商業化試劑盒提取RNA。
B.2.2.4 AMV逆轉錄酶、DNA聚合酶和dNTP等；可用一步法熒光定量RT-PCR試劑。
8.2.3 B.2.3 步驟
B.2.3.1 總RNA提取：按試劑說明提取細胞總RNA，製備模板RNA。
B.2.3.2 設計對照，A：陽性對照：滅活病毒對照。B：正常細胞對照。C：試劑對照：用去離子水代替標本。
B.2.3.3 一步法熒光定量反應體系：不同試劑盒、不同熒光定量儀器的反應體系及試劑名稱不同，本文以一步法單通道檢測EV-A71反應體系爲例，具體配置見表B.3。
表B.3 RT-PCR檢測EV-A71反應體系配置（25 μL體系）
試劑名稱 | 體積 |
2×one step RT-PCR buffer | 12.5 μL |
Ex Taq HS | 0.5 μL |
RT-Enzyme Mix II | 0.5 μL |
EV-A71上游引物：(20 μM) | 0.8 μL |
EV-A71下游引物：(20 μM) | 0.8 μL |
EV-A71探針(20 μM) | 0.4 μL |
RNase Free dH20 | 5.5 μL |
RNA模板 | 4μL |
B.2.3.4 一步法熒光定量RT-PCR擴增：每管加入相應的標本或對照核酸、引物和探針（依據單通道，雙通道或三通道加入相應的探針）和熒光定量RT-PCR試劑。特異性擴增目的基因片段，反應條件（依據使用的試劑盒有所不同）：42℃逆轉錄30 min；95℃變性2 min；94℃ 10 s，5℃ 35 s，共擴增40個循環。
8.2.4 B.2.4 結果判斷
閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，或可根據儀器噪音情況進行調整。標本的實驗室診斷結果與普通RT-PCR法相同，詳見B.1.3。閾值設定原則以不同商業化試劑盒設置的閾值線爲準，通常試劑盒結果判斷如下：
c) Ct 值 35.0～38.0 的樣本建議重做。
9 附錄C（規範性附錄）手足口病相關腸道病毒的分離和鑑定
9.1 C.1 腸道病毒分離
9.1.1 C.1.1 標本處理
C.1.1.1 糞便標本的處理：在生物安全櫃中，取約2 g糞便標本、10 mL含有抗生素的完全PBS、1 mL三氯甲烷加入50 mL耐三氯甲烷的離心管中。使用機械振盪器劇烈混勻20 min，製成糞便懸液。然後3 000 r/min離心20 min。在生物安全櫃中吸上清至一新凍存管中，以備接種。
C.1.1.2 腦脊液標本的處理：腦脊液標本通常直接用於病毒分離。
C.1.1.3 皰疹液標本的處理：皰疹液標本通常直接用於病毒分離。
C.1.1.4 咽拭子標本的處理：咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分振盪10 s～15 s，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，然後在4℃條件下，10 000 r/min離心20 min，用上清接種到細胞上，如果發現有細菌污染，應用濾器過濾除菌。
9.1.2 C.1.2 所需材料
RD、Vero或HEp-2等細胞；使用8mL斜面細胞培養管。
9.1.3 C.1.3 操作步驟
C.1.3.1 顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康的。傳代後48 h～72 h接種。
C.1.3.2 倒掉生長液（GM），換上1 mL～1.2 mL的維持液（MM）。
C.1.3.3 每一份標本至少需要同時接種2種細胞，2支RD細胞和2支HEp-2細胞；必要時增加Vero細胞。正確標記每支細胞培養管（包括標本的編號、日期、傳代數）。
C.1.3.5 每支試管接種0.2 mL的標本懸液，培養溫度要求36℃。
C.1.3.6 使用倒置顯微鏡每天觀察細胞培養管，以觀察有特徵性的腸道病毒致細胞病變效應（CPE）的出現（如細胞變圓，折光增強並脫離管壁等）。
C.1.3.7 記錄接種管和對照管細胞所發生的變化至少一週，每天觀察細胞有無毒性反應、老化或污染，記錄CPE動態變化（1+，＜25％；2+，25％～50％；3+， 50％～75％；4+，75％～100％）。
C.1.3.8 如果有特徵性的腸道病毒CPE出現要如實記錄，並觀察直到75％的細胞出現CPE時，將分離物儲藏在－30℃低溫冰箱以備二次傳代。
C.1.3.9 第1代培養見可疑細胞病變時繼續傳1代～2代，待細胞病變穩定出現後，－30℃低溫冰箱保存。
C.1.3.10 一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現，將病毒保存在－70℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高於用一代病毒，所以選用二代病毒進行鑑定。
9.2 C.2 結果判斷
C.2.2 如果7 d之後沒有CPE出現，盲傳1代繼續觀察7 d。盲傳2代後，仍然沒有出現CPE的，則判定爲病毒分離陰性。
11 解讀
手足口病是全球性傳染病，已發現20餘種腸道病毒可引起手足口病，2008年納入丙類法定管理傳染病，在我國丙類傳染病中發病率和病死率居於首位，已成爲我國最重要的急性傳染病之一。制定手足口病診斷標準，有助於進一步規範手足口病的診斷和鑑別診斷，加強手足口病的防治，爲手足口病的防治提供科學的依據。
世界衛生組織制定併發布了《 手足口病臨牀管理及公共衛生應對指南》，對手足口病的流行病學、病毒學、實驗室診斷、EV-A71 的致病機制、臨牀特徵及病例管理、預防與控制等進行了統一規定。
本標準內容主要包括：前言，範圍，術語和定義，縮略語，診斷依據，診斷原則，診斷，鑑別診斷和3個規範性附錄。
在診斷依據部分，列出了手足口病的流行病學特點、臨牀表現和實驗室檢查。診斷原則，一是根據臨牀表現及實驗室檢查結果課做出臨牀診斷和分型。流行病學資料可做參考；二是確診需要手足口病相關病原學和血清學檢測的陽性結果。診斷分爲臨牀診斷病例、確診病例。臨牀分型分爲普通型、重型、危重型。鑑別診斷應注意與其他出疹性疾病、其他病毒所致腦膜炎或腦炎、脊髓灰質炎、肺炎鑑別。本標準適用於全國各級各類醫療衛生機構及其醫務人員對手足口病的診斷。