2 別名
直接膽紅素與間接膽紅素比值；DBIL/IBIL
6 原理
（1）改良咖啡因（J-G）法的原理：
血清中結合膽紅素可直接與重氮試劑反應，產生偶氮膽紅素；在同樣條件下，遊離膽紅素需有加速劑使膽紅素氫鍵破壞後與重氮試劑反應。咖啡因、苯甲酸鈉爲加速劑，醋酸鈉維持pH同時兼有加速作用。抗壞血酸（或疊氮鈉）破壞剩餘重氮反應，終止結合膽紅素測定管的偶氮反應，防止遊離膽紅素的緩慢反應。加入鹼性酒石酸鈉使最大吸光度由530nm轉移到598nm，非膽紅素的黃色色素及其他紅與棕色色素產生的吸光度降至可略而不計，使靈敏度和特異性增加。最後形成的綠色是由藍色的鹼性偶氮膽紅素和咖啡因與對氨基苯磺酸之間形成的黃色色素混合而成。
（2）膽紅素氧化酶法的原理：
膽紅素氧化酶（BOD）催化膽紅素氧化，生成膽綠素，後者進一步氧化生成淡紫色化合物，在450nm波長比色，吸光度的下降值（△A）與血清膽紅素濃度呈正比。
7 試劑
（1）改良咖啡因（J-G）法：
①咖啡因-苯甲酸鈉試劑：稱取無水醋酸鈉41.0g（或CH3COONa·3H2O 63.0g），苯甲酸鈉38.0g，乙二胺四乙酸二鈉（EDT-ANa2）0.5g，溶於約500ml蒸餾水中，再加入咖啡因25.0g，攪拌使溶解（加入咖啡因後不能加熱溶解），用蒸餾水補足至1000ml，混勻。用濾紙過濾，置棕色瓶，室溫保存。
②鹼性酒石酸鈉溶液：稱取氫氧化鈉75.0g，酒石酸鈉（Na2 C4H4O6·H2O）263.0g，用蒸餾水溶解並補足至1000ml，混勻。置塑料瓶中，室溫保存。
③5.0g/L亞硝酸鈉溶液：稱取亞硝酸鈉（NaNO2）5.0g，用蒸餾水溶解並稀釋到100ml，混勻，置棕色瓶中，冰箱保存，穩定不少於3個月。作10倍稀釋成0.5g/L，貯冰箱穩定不少於2周。
④5.0g/L對氨基笨磺酸溶液：稱取對氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g/L，溶於800ml蒸餾水中，加入濃鹽酸15ml，用蒸餾水補足至1000ml。
⑤重氮試劑：臨用前取5.0g/L亞硝酸鈉溶液0.5ml和5.0g/L對氨基苯磺酸溶液20ml混合。
⑥5.0g/L疊氮鈉溶液：稱取疊氮鈉0.5g，以蒸餾水溶解並稀釋至100ml。
⑦膽紅素標準液
A.一般用遊離（非結合）膽紅素配製標準液，因此配製標準液的稀釋劑需含白蛋白。可用牛血清白蛋白（40g/L）或人血清代替人血清白蛋白。後者方法如下：收集無溶血、無黃疸、無脂濁的新鮮血清，混合，必要時可用濾菌器過濾。取過濾後的血清1ml，加入24ml新鮮生理鹽水，混合。在414nm波長，1cm光徑，以生理鹽水調零點，其吸光度應小於0.100；在460nm的吸光度應小於0.04。
B.配製標準液的膽紅素須符合下列標準：純膽紅素的氯仿溶液，在25℃條件下，光徑10±0.01mm，波長453mm，摩爾吸光係數應在60700±1600範圍內；改良J-G法偶氮膽紅素的摩爾吸光係數應在74380±866。
C.膽紅素貯存標準液，171μmol/L（10mg/dl）：準確稱取符合要求的膽紅素10mg，加入1ml二甲亞碸，用玻璃棒攪拌，使成混懸液。加入0.05mol/L碳酸鈉溶液2ml，使膽紅素完全溶解，移入100ml容量瓶中，以稀釋用血清洗滌數次併入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml，邊加邊搖（勿用力，以免產生氣泡）。最後以稀釋用血清補足至100ml。配製過程中應儘量避光，貯存容器用黑紙包裹。置4℃冰箱3天內有效，但要求配後儘快作標準曲線。
（2）膽紅素氧化酶法：
①0.1mol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.2：稱取Tris 1.211g，膽酸鈉172.3mg，SDS432.6mg，溶於90ml蒸餾水中，在室溫（25～30℃）用1mol/L鹽酸調節pH至8.2（約用6ml），再加蒸餾水至100ml，置冰箱保存。此液含4mmol/L膽酸鈉、150mmol/L SDS。
②BOD溶液：如系凍幹品，按介紹要求復溶，但復溶後冰箱保存不宜過長（約可保存1周）。如系液體（可能含有甘油），置冰箱或冰室可保存較長時間，BOD貯存液的酶活性一般在數千至1～2萬U/L，BOD工作液的酶活性可按反應液中BOD終濃度達0.3～1.0U/ml計算。
