3 概述
流行性感冒病毒（influenza virus）分爲甲、乙、丙3個型，甲型流感病毒可引起世界性大流行。流感病毒爲分節段的單股負鏈RNA病毒，與核酸結合在一起的蛋白質爲核蛋白（nucleoproteiN,NP），NP抗原穩定，具有型特異性。病毒核心外面是與病毒包膜緊密結合的基質蛋白（M蛋白），最外面是病毒的包膜，包膜上有兩種刺，一種爲血凝素（hemagglutinin，HA），一種爲神經氨酸酶（neuraminidase，NA），兩者均易變異。
臨牀上流感病毒的實驗室診斷可用血清學方法查抗體，也可用快速方法直接查抗原。查抗體的血清學方法有血凝抑制試驗、補體結合試驗、中和試驗和ELISA等，但用的最多的是血凝抑制試驗。查抗原的快速方法有直接和間接免疫熒光法、放射免疫法、ELISA法、免疫電鏡法等，但用的最多的是間接免疫熒光法和ELISA法。此外，亦可用PCR法和核酸雜交法查核酸。
4 流感病毒抗體的醫學檢查
4.1 檢查名稱
4.2 分類
4.3 化驗取材
4.4 流感病毒抗體的測定原理
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：以感染及未感染合胞病毒的細胞培養分別製備合胞病毒抗原及細胞對照抗原，分別包被於聚苯乙烯板上製成固相抗原，加入待檢血清後，血清中如含有抗合胞病毒抗體，則可結合於包被的合胞病毒抗體（而對照抗原則不能結合），形成抗原-抗體複合物，再加入酶標記的抗人IgG（即抗抗體），則形成抗原-抗體-酶標記抗抗體複合物，當加入相應酶的底物，在酶的催化作用下使原來無色的底物水解，氧化，還原呈現顏色反應。通過觀察顏色反應的強弱來了解抗體的存在及其滴度。
4.5 試劑
（1）在8×12或4×10孔塑料上長成片的狗腎傳代細胞（MDCK）
（3）洗滌液：上述稀釋液中加0.5g/L Tween20。
（4）pH5.0基質液
（5）底物液10ml pH5.0的基質液加4mg鄰苯二胺加30%雙氧水（H2O2）5μl，充分混勻（必須使用前新配）。
（6）終止液：4mol/L HCl或H2SO4。
（8）流感病毒株特異的免疫血清或小白鼠混合的單克隆抗體，當然也可用雞免疫血清。國外常用型特異的小鼠抗血清。
（9）辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌A蛋白（SPA）或辣根過氧化物酶標記的馬抗小鼠的IgG抗血清。這些可購買於生物試劑商店。而抗雞血清IgG需自己製備和標記。
（10）鑑定標本：用pH7.4的Hank液或199或Eagle液或滅菌的生理鹽水（後者很少用），讓流感樣患者含嗽咽部後收回；當前人羣中流行的甲、乙型流感病毒（陽性對照）。
4.6 操作方法
（1）鑑定血清工作濃度的滴定：成片的MDCK細胞，如它是培養在4×10孔的板中，倒掉培養液，用Hank液洗1～2次，第1和2排接種10－1的甲型流感病毒（當前流行株），第3和4排接種10－1的乙型流感病毒（當前流行株）。其維持液可用199或Eagle氏液，但不含小牛血清而含終濃1μg/ml的胰酶，35℃ CO2孵箱培育過夜，取出，倒掉維持液，每孔加入0.1m 180%丙酮，量4℃ 30min（固定細胞），倒掉丙酮，用稀釋液洗1遍，第1，3排和第2，4排，第1～9孔分別加入0.1ml不同稀釋度（一般1/200～1/51200）的甲型和乙型抗血清。4排的第10孔均加0.1ml稀釋液（病毒對照）。其餘步驟同下面（4～7步驟）。用肉眼觀察，能顯示顏色並其強度明顯高於病毒和陰性血清孔的血清最高稀釋度的倒數，如1/12000，使用濃度爲兩倍量即1/6400。
（2）標本接種：取標本上清3ml，按每ml加青黴素1000u，鏈黴素1000μg，混勻置4℃ 2h後方可接種細胞。
成片的MDCK細胞，長在塑料板孔中或細胞管中均可（無CO2孵箱的單位，可用細胞管，一管相等於一個孔，其餘操作均一樣），用Hank液洗1～2次，每份標本種12個孔，每孔0.1ml，10－1稀釋度的甲、乙型流感病毒按同法各種4個孔，另4孔爲細胞對照僅加0.1ml維持液（不管接種標本有多少份細胞對照2～4個孔已足夠），置35℃ CO2孵箱吸附1h，倒掉接種液，用Hank氏液洗1遍接着同步驟1；每孔加入0.1ml維持液，35℃ CO2孵箱培育過夜，倒掉維持液，丙酮固定，洗1遍。
（3）加抗血清：接種標本的12孔分成3組，每組4孔，第一和第二組，分別加入工作濃度（用稀釋液配製）的甲型和乙型抗血清，0.1ml/孔；第三組與細胞對照孔各加入0.1ml稀釋液；接種甲型病毒和乙型病毒孔，分別加入0.1ml工作濃度的同型抗血清。置室溫1h。
（4）加辣根過氧化物配標記的SPA（加何種應根據所用抗血清種類而異）倒掉孔中溶液，用洗滌液洗3～5次，最後一遍後將板孔朝下，底朝上，在普遍濾紙上輕輕敲打，將孔中溶液儘量棄盡。每孔中加入0.1ml工作濃度的辣根過氧化物酶，置室溫2h。
（5）加底物：倒掉酶，按步驟4中洗之，每孔加入0.1ml底物溶液，速放暗盒中，置室溫30min。
（6）結果觀察：從暗盒中取出速觀察之，先觀察對照孔：細胞對照孔不應出顏色，最多隻能出極淡的黃色；甲、乙型對照孔應出黃色（如不出，對照有問題，實驗需重做）；標本接種的第一組黃色出現，第二組無色，表明分離爲甲型流感病毒，反之第二組出現黃色，第一組不出，表明分離物爲乙型流感病毒；第一、二組均不出現黃色，表明標本中不含有甲、乙型流感病毒。
（7）反應終止：一般不需做此步，如需測定吸光度，在每孔中加入0.05ml終止液。然後，在495nm波長下進行測定。
4.7 正常值
陰性。
4.8 化驗結果臨牀意義
由於流感病毒感染普遍，且存在回憶反應，同時同一亞型不同年代變異毒株間均存在有不同程度的抗原性交叉，因此，患者血清中是否存在有流感病毒抗病毒抗體或抗體高低，不能做爲確切診斷的證據。必須採集患者急性期（發病的頭3天）和恢復期（發病後2～3周）的血清，在同一條件下進行測定，凡恢復期血清中抗體效價比急性期高4倍以上者，纔可確認是流感患者。另外，由於流感病毒抗原性變異極爲複雜，不同地區，甚至同一地區不同單位所流行毒株的抗原性不盡完全相同。因此，進行抗體測定時，所用的抗原最好用當時當地的流行株加上全國的代表性毒株。
4.9 附註
（1）由於流感病毒HA抗原性經常地發生變異，因此，用株特異性抗血清時，應隨毒株抗原性變異而更改，否則會使鑑定敏感性下降。故應用型特異的抗血清較爲合適。
（2）應用單克隆抗體時，應採用多個單克隆相混的抗體，否則會漏檢。
（3）本實驗在流感診斷中是個定性測定，故用肉眼觀察就可。
（4）SPA不結合雞血清中IgG，故用雞免疫血清測定時，不能用辣根過氧化物酶標記的SPA。
（5）常規ELISA測定中所需注意事項均適合本實驗。