3 凍幹基因工程α1b干擾素製造及檢定規程
[1]本品系用從健康人白細胞中獲得的α1b干擾素基因重組質粒，轉染大腸桿菌，使之高效表達人α1b干擾素，經高度純化後凍乾製成。用於治療慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛細胞白血病等疾病。
3.1 菌種
1.1菌種來源
繫帶有人α1b干擾素基因的pBVXα1b質粒轉化的大腸桿菌JM103株。投產的工程菌需經衛生部批准。
1.2菌種特性
從原始菌種庫傳出，經擴大後凍幹保存，或由上一代製造用菌種庫傳出，擴大後凍幹保存作爲製造用菌種庫，但每次只限傳三代。每批製造用菌種庫均應進行下列檢定，合格後方可投產。
1.3.1劃種LB瓊脂平板
1.3.2塗片革蘭氏染色
1.3.3對抗生素的抗性
應與原始菌種相符。
1.3.4電鏡檢查
應爲典型大腸桿菌形態，排除支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。
1.3.6干擾素表達量
在搖牀中培養，應符合原始菌種的表達量。
1.3.7表達的干擾素型別
1.4種子液製備
液體LB培養基不含瓊脂，供搖牀培養用，含2%瓊脂供製備平板和斜面用，含0.5%瓊脂的半固體供短期保存菌種用。
1.4.2生產菌種的製備和檢定
取製造用菌種庫凍幹菌種，開啓後劃種培養基平板2～3塊，培養後挑取平板中典型集落8～10個，分別培養後保存，然後分別進行干擾素表達量測定，至少重複一次，先其中干擾素表達量最高的一份供生產製備種子液用，其表達量應符合原始菌種庫的表達量，所表達的干擾素應用標準抗α型干擾素血清作中和試驗，證明型別無誤。
1.4.3種子液的製備
將菌種接種M9CA培養基，在搖牀中培養至OD值在0.4～0.8之間即可供發酵罐接種用。種子液應進行質粒穩定性檢查。
3.2 發酵
2.2發酵用GMD培養基，用蒸餾水配製，其中不含有任何抗生素，配製後進行實罐滅菌。
2.3發酵溫度爲36.5±0.1℃，根據工程菌生長情況到後期可適當調整溫度，並作必要的培養基成分添加，發酵時間根據工程菌生長情況確定。發酵結束時放出菌液，發酵灌應再進行一次滅菌並清洗。
3.3 收菌
用離心法收取菌體，稱重，容器上標明批號、罐別、重量、日期。收穫的菌體如在24小時內破菌裂解可保存於4～8℃冷庫，否則應置?/FONT>30℃凍存。
3.4 菌體裂解與粗製干擾素製備
用高壓勻漿法裂解菌體，將菌體作成10%～20%的懸液進行高壓勻漿，壓力50Mpa/cm2，連續勻漿二次，勻漿後的懸液離心後取上清即爲粗製干擾素。
3.5 濃縮與純化
5.1初步純化
採用不同原理多步驟的方法，使初步純化的干擾素達到外觀無色透明，無絮狀物，比活性在105IU/mg蛋白以上，並將其濃縮至原體積的1/10～1/20，保存於4℃，如3天內不能進行高度純化，應凍存於?/FONT>30℃冰箱內。
5.2高度純化
經初步純化後進行高度純化，去除絕大部分非干擾素蛋白，使其達到本規程7～8項要求。高度純化應在潔淨度爲10000級的恆溫（15～18℃）室內進行。
5.3在高度純化過程中應進一步濃縮，使體積爲初步純化干擾素的1/5～1/10。並應轉換緩衝液系統，使之適合於人體注射用。
5.4在整個濃縮與純化過程中不得加入對人體有害的物質。
5.5在濃縮純化過程中應特別注意去除熱原質，用於分子篩層析的溶液，配合後應進行去除熱原質處理。容器應乾熱滅菌，不能乾熱滅菌者應用適當濃度的NaOH處理。
5.6濃縮純化最後所得的純化干擾素即爲“半成品原液”，取樣進行7.1～7.4項檢定後，立即加入人白蛋白，使其最終含量爲2%，稱爲“加白蛋白半成品”，取樣測定干擾素效價，其餘凍存於－30℃冰箱中，應儘量避免凍融。
5.7所用的人白蛋白應符合相應規程要求，HBsAg。
3.6 稀釋、除菌過濾
6.1將檢定合格的加白蛋白半成品以乳徑爲0.22μm的濾膜除菌過濾，除菌後立即進行稀釋。
6.2稀釋液製備
用合格的蒸餾配製生理鹽水，經高壓滅菌，加入檢定合格的注射用人白蛋白，使最終含量爲2%，即爲稀釋液。配製後應立即用於稀釋。
6.3稀釋
除菌後加白蛋白半成品用稀釋液稀釋至所需濃度。稀釋後用孔徑爲0.22μm濾膜過濾除菌，保存於4℃，並取樣作無菌試驗和熱原試驗，合格後進行凍幹。
3.7 半成品檢定
每批半成品抽樣進行7.1～7.7項檢定。啓開新菌種生產的前3批或生產條件有較大改變時進行7.8～7.12項檢定。
7.1效價測定
用細胞病變抑制法，Wish細胞/VSV爲檢測系統。用國家參考品校準爲IU。
7.2蛋白含量
用Lowry法測定。同批不同階段的樣品比較時應儘可能同時測定。
7.3比活性
根據效價測定及蛋白含量計算比活性，本品的比活性應在107IU/mg蛋白以上。
7.4純度
7.4.1電泳純度
用非還原型SDS?/FONT>PAGE法，加樣量不低於5μg，經掃描儀掃描，純度應在95%以上，聚合體不得超過10%。
7.4.2高效液相色譜純度
用280nm檢測，應呈一個吸收峯，或主峯佔總面積95%以上。
7.5分子量測定
用還原型SDS?/FONT>PAGE法。加樣量不低於5μg。製品的分子量與理論值比較，誤差不超過10%。
7.6殘餘外源性DNA含量
用固相斑點雜效法，以地高辛標記的核酸探針法測定，其含量應少於100pg/劑量。
7.7殘餘IgG含量
如採用單克隆抗體親和層析法純化，應進行本項檢定。採用ELISA雙抗體夾心法測定，IgG含量應少於100ng/劑量。
7.8殘餘工程菌蛋白含量
用酶標法或其他敏感方法測定，殘餘工程菌蛋白不得超過總蛋白的0.02%.
7.9抗生素活性
7.10肽圖測定
應符合α1干擾素的圖形，批與批之間圖形應一致。
7.11等電聚集
測定等電點，應有固定的範圍（4.0～6.5之間）。
7.12紫外光譜掃描
檢查半成品的光譜吸收值，批與批之間應一致，應有固定的最大吸收值。
3.8 除菌半成品檢定
8.1效價測定
同7.1項。
8.2無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
8.3熱原質試驗
按《生物製品熱原質試驗規程》進行。每隻家兔靜脈注射干擾素5萬，判定標準按該規程4.1項要求進行。
3.9 成品檢定
9.1處觀
應爲微黃色薄殼狀疏鬆體，加入1ml蒸餾水後溶解迅速，不得含有肉眼可見的不溶物。
9.2 pH值
pH值應爲6.5～7.5。
9.3無菌試驗
同8.2項。每批抽樣不少於10支。
9.4水分
應≤3%。
9.5熱原質試驗
同8.3項。
9.6價測定
同7.1項。效價應爲標示量的80%～150%。
9.7安全試驗
9.7.1豚鼠試驗
用體重300～400g豚鼠2只，每隻腹側皮下注射1ml（於1ml生理鹽水內），觀察7天，豚鼠應健存，每隻體重增加判爲合格。
9.7.2小白鼠試驗
用體重18～20g小白鼠5只，每隻腹腔注射0.5ml（於0.5ml生理鹽水內），觀察7天，動物應健存，每隻體重增加判爲合格。
3.10 規格
10μg/瓶，20μg/瓶和30μg/瓶。
3.11 保存與效期
4 凍幹基因工程α1b干擾素使用說明書
本品系用健康人白細胞中獲得的α1b干擾素基因組建雜交質粒，轉化大腸桿菌，使之高效表達人α1b干擾素，經高度純化後凍乾製成。本品爲微黃色疏鬆體，每支含α1b干擾素10μg、20μg或30μg，相當於用MDBK/EMC系統測定的效價100萬單位，200萬單位和300萬單位，用於慢性乙型肝炎、丙型肝炎及毛細胞白血病的治療。
4.1 用法
每支用滅菌注射用水1ml溶解，肌內或皮下注射，不得靜脈注射，建議晚上給藥。劑量及療程推薦如下：
毛細胞白血病：40～60μg，每天注射一次，連續用藥6個月以上。可根據病情適當調整，緩解後可改爲隔天注射1次。
慢性乙型肝炎：40μg（20～60μg），每天注射一次，或在用藥4周後改爲每週3次，連續治療3個月或更長。
4.2 副反應
最常見的副反應爲發熱和疲勞，常在開始用藥階段出現，多數爲低熱（38℃以下），一般爲一過性。其他副反應有頭痛、肌痛、關節痛、食慾不振、噁心等。
如出現上述患者不能忍受的嚴重副反應，應減少劑量或停藥，並進行對症治療。
4.3 禁忌證
1.已知對干擾素製品過敏者；
3.有其他嚴重疾病，不能耐受本品之副反應者；
4.4 注意事項
1.凡有明顯過敏體質，特別是對抗生素有過敏者，本品應慎用， 必須使用時應先用本品作皮膚試驗（1:100稀釋，皮內注射），陰性者方可使用。在使用過程中如發生過敏反應應立即停藥，並給予相應治療。
2.使用前應仔細檢查安瓿，如安瓿有裂縫、破損不可使用。在加入滅菌注射用水後稍加振盪，製品應溶解良好，如有不能溶解的塊狀或絮狀物，不可使用。
3.製品溶解後應一次用完，不得分次使用。
4.5 保存
保存於2～8℃暗處。
5 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》"．