1 拼音
kàng bìng dú yào wù bìng dú xué yán jiū shēn bào zī liào yào qiú de zhǐ dǎo yuán zé
《抗病毒藥物病毒學研究申報資料要求的指導原則》由國家食品藥品監督管理局於2012年5月15日國食藥監注[2012]122號印發。
2 一、概述
病毒感染是危及人類健康和生命的疾病之一，目前已有很多抗病毒藥物上市應用，但仍不能完全滿足臨牀治療的需求。近年來國內外相關製藥企業不斷投入大量資金研發抗病毒藥物，抗病毒藥物的註冊申請也逐漸受到各方面的關注。
根據試驗數據撰寫的非臨牀和臨牀病毒學研究報告是審評抗病毒藥物的臨牀試驗申請和上市申請的重要資料。本指導原則旨在幫助研發抗病毒藥物或生物製品（例如：治療性蛋白和單克隆抗體）的申請人初步瞭解哪些非臨牀和臨牀病毒學研究數據對於抗病毒藥物或生物製品申報臨牀試驗或申請上市是最關鍵的。
本指導原則主要關注非臨牀和臨牀病毒學研究報告，同時對需要收集和提交的耐藥性研究數據提出了建議。討論的主要問題包括：
· 明確作用機制
3 二、背景
近年來，國內外在抗HIV-1藥物的研究方面積累了大量的經驗，也取得了很多進展。因此，本指導原則以抗HIV-1藥物爲範例，介紹抗病毒藥物病毒學研究的一般原則。儘管不同病毒的檢測方法和模型系統有較大的差異，但本指導原則的許多抗HIV藥物研發的原則適用於治療其他病毒感染（如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、流感病毒、鼻病毒、鉅細胞病毒及人乳頭瘤病毒等國內常見病毒）的抗病毒藥物的研發。病毒學領域研究發展日新月異，所以，當積累了新的資料或出現相關需求時，我們將對本指導原則進行修訂。
4 三、非臨牀病毒學研究
非臨牀病毒學研究有助於在進行人體試驗前評價藥物的有效性和安全性。建議申請人進行藥物的作用機制、藥物在模型系統中的特定抗病毒活性的研究，並提供對藥物產生耐藥的病毒學數據。此外，臨牀上常將一種藥物與其他已上市的治療相同適應症的藥物聯合使用，因此，最好通過體外試驗研究兩種或兩種以上藥物聯合用藥的抗病毒活性，以便發現所研究藥物與其他抗病毒藥物之間可能存在的相互作用（如拮抗、協同、增強、疊加等），尤其應關注負面的相互作用。
由於已上市的抗病毒藥物很多，交叉耐藥（病毒對一種藥物耐藥後，對同類的其他藥物也產生了耐藥性）可能會成爲臨牀應用中的一個主要問題。因此，在抗病毒藥物的研發過程中，下列信息顯得非常重要：
l 測定所研究藥物對相同作用靶點的其他已上市藥物的耐藥病毒株的抗病毒活性。
l 測定已上市藥物對由相同作用靶點的所研究藥物誘導的耐藥病毒株的抗病毒活性。
申請人在開始I期臨牀試驗前應先進行非臨牀研究（如作用機制研究、體外抗病毒活性研究、耐藥性研究，以及血清蛋白結合率對抗病毒活性影響的研究等）。
如果病毒有合適的體外感染模型系統，在開始旨在考察所研究藥物與其他抗病毒藥物合用療效的臨牀試驗前，申請人應完成所研究藥物與其他已上市的針對此病毒藥物合用的體外活性研究，如針對相同靶點有多種已上市的藥物和研究藥物，應從每一類藥物中至少選一種有代表性的藥物進行研究。
在對感染某一種病毒的患者進行臨牀試驗前，應先通過體外試驗誘導對所研究藥物耐藥的病毒株，並鑑定耐藥病毒株的表型和基因型及交叉耐藥性。
4.1 （一）作用機制研究
在I期臨牀試驗前應進行作用機制研究。充分掌握藥物的作用機制對於臨牀試驗的設計非常重要，可使研究者瞭解病毒基因組中發生導致耐藥性突變的可能區域，這些區域不僅限於所研究藥物作用的靶位（病毒編碼的靶點），也可能包括酶的底物或靶蛋白複合物中存在的另外的病毒或宿主編碼蛋白。耐藥性突變的鑑定結果也可以爲機制研究和臨牀研究提供依據。
病毒生命週期中的許多階段都可以成爲潛在的抗病毒藥物的作用靶點。藥物可以通過作用於病毒特異性的編碼功能而發揮直接的抗病毒作用（如酶抑制劑），或者通過其他途徑而發揮間接的抗病毒作用（如干擾素誘導的宿主細胞應答）。建議進行如下作用機制研究：
· 證明藥物具有特異性地抑制病毒複製或抑制病毒特定功能的能力。
· 確定藥物作用的靶點（如病毒複製酶、蛋白酶等）或作用於病毒複製的哪個階段（如病毒進入、入核等）。
申請人可提供支持其藥物作用機制的生物化學、結構學、細胞學、遺傳學等方面的數據。證明藥物作用機制的數據包括但不僅限於受體結合、抑制酶活性、確定抑制劑與受體複合物結合的X-光晶體結構、編碼靶蛋白基因的耐藥性突變位點的鑑定等。
應比較所研究藥物對病毒靶點及細胞或宿主蛋白作用的選擇性，當宿主細胞中存在或可能存在與病毒酶類似的酶時，此點尤其重要。例如，如果藥物的作用靶點是病毒聚合酶，建議申請人證明該藥物對病毒聚合酶的抑制活性，同時比較其對宿主細胞的DNA聚合酶（如DNA聚合酶α、β及γ）的抑制活性。
研發免疫調節劑還應注意更多問題。此類藥物會對機體的免疫系統產生作用，因而可能會對病毒的複製起不到抑制作用，或者對機體產生其他不良影響。對於通過刺激全身免疫反應而發揮作用的免疫調節劑，建議申請人證實其抗病毒活性，並鑑定出參與作用的免疫分子或免疫細胞。
4.2 （二）抗病毒活性
4.2.1 1.體外抗病毒活性
許多感染人體的病毒可以在細胞培養系統或動物宿主體內完成完整的生命週期。在這樣的情況下，建議申請人在開始I期臨牀試驗前先通過體外試驗證明所研究藥物和/或其代謝產物的特異的、可定量的抗病毒活性。這些數據應能清楚地證明在體內、在可接受的風險/收益比的情況下達到的藥物濃度具有抗病毒作用，從而爲人體試驗提供支持，這一點非常重要。此外，使用相關的細胞和病毒臨牀分離株進行的體外抗病毒活性和細胞毒性評價[見第三部分（三）細胞毒性和治療指數]可以指導早期臨牀試驗選擇合適的劑量範圍。
鼓勵申請人使用人靶細胞的原代培養細胞進行抗病毒活性研究。由於病毒的基因容易發生變異，所以應使用多種臨牀分離株考察所研究藥物的抗病毒活性，臨牀分離株應能代表臨牀試驗中的病毒羣。建議進行的抗病毒活性研究包括：
· 評價所研究藥物對一系列病毒實驗室適應株和臨牀分離株（包括不同的亞羣（clades）、亞型（subtypes）或基因型（genotypes））的特異性抗病毒活性。
· 評價所研究藥物對相同作用靶位或複合物藥物耐藥的病毒株、對其他已上市具有相同適應症的藥物耐藥的代表性耐藥病毒株的抗病毒活性。
應使用定量的檢測方法，在不同濃度藥物的條件下測定病毒的複製，並與不添加藥物的測定結果進行比較，確定藥物的劑量依賴的特異性抗病毒活性。
藥物的有效濃度是指使病毒複製的水平降低50%的濃度（細胞培養試驗中用EC50表示，生物化學或亞細胞試驗中用IC50表示）。評價藥物的抗病毒活性和細胞毒性的方法包括但不侷限於病毒滅活試驗、空斑減數試驗、細胞病變效應抑制試驗、病毒抗原或核酸檢測、感染性病毒顆粒檢測、含報告基因的病毒或細胞檢測等。可能影響這些試驗的因素包括病毒感染複數（Multiplicityof Infection，MOI）和給藥時間（如病毒感染前給藥或感染後不同時間給藥）。建議申請人使用傳代次數較少的宿主細胞進行研究。
藥物的有效濃度與作用機制研究的數據應一致，如果藥物抑制病毒複製所需的濃度低於根據假定的作用機制計算出的生化數據，則提示可能還存在其他的作用位點或機制。當抗病毒活性數據與生化數據不一致時，可以通過耐藥性分析證明藥物在體內的作用機制。對於核苷或核苷酸類似物，建議在細胞的穩定期及分裂期測定藥物活性分子的三磷酸鹽的半衰期（t1/2）。
某些影響人類健康的病毒（如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等）目前尚無合適的細胞培養系統或動物模型。對於此類病毒，可以通過對親緣關係很近的病毒關鍵功能和活性的抑制揭示藥物的潛在抗病毒活性。如果目標病毒目前尚無合適的細胞培養系統或動物模型，而且藥物的作用部位被認爲位於細胞內、細胞內的藥物濃度與生化研究中的結果一致時，確定抗病毒藥物的活性部分能否進入細胞內尤爲重要。目前用於研究乙型肝炎病毒（HBV）的細胞系和基於細胞的檢測方法還非常有限。研究丙型肝炎病毒（HCV）進入、複製和感染的基於細胞的試驗取得了一定進展，但還存在很多不足。
· 通過生物化學試驗測定HBV DNA聚合酶的活性。
· 使用桿狀病毒介導的轉入或轉染HBV基因組到人肝細胞株進行細胞培養試驗，然後用HBV DNA探針經Southern Blot定量分析檢測HBVcccDNA及RI-DNA等的形成。
· 用含有HBV基因組（複製可調控或不可調控）的穩定轉染細胞株進行細胞培養試驗。
對於HCV,目前有用於研究病毒進入（或受體）的假病毒系統（HCVpp）、研究病毒複製的複製子系統（Replicon）以及研究完整病毒複製週期的病毒感染系統（HCVcc），這些系統均可用於評價藥物對HCV的抗病毒活性。遺憾的是HCVcc系統目前僅在2a亞型中取得成功。目前用於評價藥物抗HCV活性的方法包括但不侷限於：
· 體外檢測藥物對病毒靶標蛋白（HCV RNA聚合酶、HCV絲氨酸蛋白酶）的抑制活性。
· 採用不同亞型複製子系統評價藥物對不同亞型HCV複製的抑制作用。通過報告基因檢測病毒抗原的表達水平，或通過RT-PCR檢測HCV複製子細胞中HCV RNA的水平。
· 在HCVcc系統中，通過檢測病毒中報告基因編碼產物（如熒光素酶或綠色熒光蛋白等）的活性反映藥物對病毒的抑制作用。也可以通過RT-PCR檢測HCV複製子細胞中HCV RNA的拷貝數，或定量檢測病毒抗原水平。
4.2.2 2.血清蛋白存在條件下的體外抗病毒活性
血清蛋白能與許多藥物結合或螯合，從而影響藥物的抗病毒活性。建議申請人詳細考察藥物是否能與血清蛋白顯著結合。測定藥物血清蛋白結合率的常用方法包括平衡透析法、超濾法以及基於熒光技術的高通量人血清白蛋白和α-酸性糖蛋白結合試驗。如果藥物的蛋白結合率較高，則建議申請人在加入系列人血清稀釋液（如5%、10%、20%、40%）條件下測定藥物的體外抗病毒活性。通過這些數據可以推算出藥物在100%人血清中的EC50，同時應報告血清校正後的EC50值。此外，建議申請人在含有生理濃度的α-酸性糖蛋白和人血清白蛋白的條件下測定藥物的EC50值。
4.2.3 3.抑制指數
血漿藥物濃度和細胞內藥物濃度對於評價抗病毒治療的量效關係和發生耐藥的可能性非常重要，計算抑制指數（Inhibitory Quotient，IQ）時也需要用到這些數據。抑制指數（IQ）等於Cmin除以血清校正後的EC50值。測定EC50值的更多信息可參閱第三部分（二）第1節-體外抗病毒活性。IQ值是一個綜合藥物的體內濃度和抗病毒活性的有用工具，也是描述藥物的暴露程度與病毒對藥物敏感性之間相互關係的一個指標。如果一種藥物的IQ較高，則表明患者體內的藥物能達到有效抑制病毒的濃度，可使耐藥發生的概率降到最低。由於同一種劑量可能並不適用於所有的患者，所以IQ值也可以用於指導III期和IV期臨牀試驗劑量的選擇。
4.2.4 4.體內抗病毒活性
在體外抗病毒活性研究的基礎上，可進一步通過動物感染模型來評價藥物的抗病毒活性。動物模型的分析指標包括病毒感染後（需要有證據證明）動物發病率和死亡率、組織學檢查、各時間點的病毒載量、在發生病毒反彈的動物體內耐藥株的分離和鑑定、病毒抗原和抗體的定量檢測、藥代動力學數據以及症狀（如神經系統症狀、體重減少等）。
4.3 （三）細胞毒性及治療指數
申請人應在臨牀試驗前開展藥物細胞毒性和治療指數的研究。需要證明藥物在體內可達到的濃度下具有抗病毒活性，同時該濃度的藥物不會對細胞產生毒性作用。應排除測定的藥物抗病毒活性是由於宿主細胞死亡所造成的可能。這一點非常重要。
在細胞毒性試驗中，應設置抗病毒藥物的濃度梯度，測定導致50%的宿主細胞死亡的濃度[參見第三部分（二）第1節-體外抗病毒活性]，即所研究藥物的半數細胞毒性濃度，通常用CC50或CCIC50來表示。治療指數或選擇性指數（即CC50/EC50）則是藥物的細胞毒性效應與抑制病毒複製效應的比值。理想的藥物應具有最大的抗病毒活性，同時具有最小的細胞毒性（即具有較大的治療指數）。
建議申請人對處於穩定期和分裂期的各種類型的、相關的人細胞和組織細胞進行CC50值的測定，確定藥物對不同細胞週期、不同細胞類型或不同組織的潛在毒性。
由於某些抗病毒藥物對骨髓有抑制作用，建議申請人採用細胞集落形成法評價某些藥物（如核苷類似物）對人骨髓祖細胞生長的潛在影響。此外，某些藥物也對負責正常細胞核DNA和線粒體DNA合成及修復的細胞DNA聚合酶具有潛在的抑制作用。申請人應測定抗病毒藥物對細胞聚合酶的IC50，同時應證明藥物對病毒靶點作用的特異性（與對細胞聚合酶的作用相比）。人體的DNA聚合酶γ負責線粒體DNA合成，人DNA聚合酶γ被抑制與線粒體功能缺損之間具有相關性，並會導致人體不良反應的發生。因此，考察某些藥物（如核苷類似物）對人聚合酶γ活性的影響以及對線粒體的毒性作用（如乳酸的生成量，線粒體DNA含量、線粒體形態學，葡萄糖利用率）就顯得非常重要。
4.4 （四）體外聯合用藥的活性分析
感染病毒的患者體內可能存在不同的病毒變異株，其中某些類型的病毒株可能對一種或多種抗病毒藥物具有耐藥性。因此，對於某些病毒而言，同時給予多種抗病毒藥物（如抗HIV-1的聯合藥物療法）可能會比使用單一的藥物產生並維持更好的抗病毒作用。但是不同藥物之間的相互作用比較複雜，聯合用藥後可能導致藥物的抗病毒活性出現相互拮抗、相加或者協同等作用。因此，申請人應在體外試驗中評價藥物與其他已上市的、治療相同疾病藥物之間聯合用藥的抗病毒活性。具體來說，應評價所研究藥物與所有已上市的針對相同靶點的藥物之間聯合用藥的抗病毒活性，對於已上市的治療相同適應症的不同靶點的藥物，應選擇兩種或兩種以上進行此類研究。
建議申請人在開始評價聯合用藥療效的臨牀試驗前，先完成體外聯合用藥的活性研究。有時患者會混合感染兩種或兩種以上的病毒（如：HIV與HBV或HCV共感染），因此，體外聯合用藥活性試驗還應考察治療同時感染不同種類病毒的藥物與所研究藥物合用的體外抗病毒活性。
4.5 （五）耐藥性
4.5.1 1.體外耐藥病毒株的選擇
本指導原則主要關注病毒基因突變導致的病毒對特定的抗病毒藥物的表型敏感性降低的耐藥性。這裏所說的耐藥性並不是絕對耐藥，而是一個相對的概念。建議在開始以感染特定病毒的患者爲對象的臨牀試驗前，先通過體外試驗選擇對藥物耐藥的病毒株，鑑定耐藥株的表型和基因型，並進行交叉耐藥性分析。儘管通過體外試驗獲得的耐藥性數據可能並不能準確預測臨牀耐藥性，但仍建議申請人通過體外耐藥株選擇試驗評價目標病毒對藥物產生耐藥性的屏障，從而有助於臨牀試驗的設計。
通過在細胞培養中選擇對藥物耐藥的病毒株，可以瞭解耐藥性產生遺傳閾值的高低。遺傳閾值低的藥物可以選擇僅含1或2個突變位點的耐藥株。而遺傳閾值較高的藥物則可能在病毒株中發生多處突變才產生耐藥性。藥物和目標病毒的許多因素可對耐藥性產生影響，如藥物濃度。突變株的出現速率取決於病毒複製速率、產生的病毒基因組的數量、複製機制的保真度以及宿主因素。對這些因素的瞭解有助於設計檢測耐藥株的體外試驗。例如，如果需要發生多個突變方可對藥物產生耐藥性，則許多細胞培養系統提供的病毒滴度可能不足以用於選擇耐藥病毒。遇到這種情況時，可以在逐漸增加藥物濃度的條件下使病毒在細胞培養中連續傳代，這樣可能會選擇出耐藥株。在評價耐藥性的體外試驗中，藥物的濃度範圍應覆蓋其在人體內的預期濃度。選擇對藥物耐藥的突變毒株的試驗應在下列條件下重復進行：使用不同的野生株、使用不同的耐藥株、高選擇壓力及低選擇壓力等，並確定不同的試驗中產生的耐藥性突變的類型是否相同，以評價藥物濃度與耐藥性遺傳屏障之間的關係。
當採用細胞培養系統複製目標病毒時，可以採用下列兩種基本方法選擇對藥物敏感性降低的病毒株：
· 病毒以較高的MOI接種宿主細胞，在多種固定的藥物濃度下分別連續傳代，誘導耐藥株的產生。
· 病毒以較低的MOI接種宿主細胞，病毒傳代期間逐漸增加藥物濃度，起始藥物濃度接近藥物對親代病毒的EC50。
採用合適的方法對病毒的複製進行監測，通過對選擇期間分離株的基因型和表型的鑑定，檢測耐藥毒株的產生。
HCV對藥物的耐藥性可以通過HCV複製子系統進行考察。使用HCV複製子細胞篩選HCV耐藥性的方法包括下列幾種：
· 在含新黴素的培養基中，多種固定的藥物濃度下，以較低的密度培養HCV複製子細胞。含有耐藥性複製子的細胞將會形成集落，應對其進行基因型和表型鑑定。
· 在不含新黴素的培養基中，多種固定的藥物濃度下，進行HCV複製子細胞傳代。收集並保存每一代HCV複製子細胞，用於表型和基因型鑑定。
4.5.2 2.基因型分析
針對體外試驗中篩選出的耐藥株進行基因型分析，確定可能導致病毒對藥物敏感性降低的基因突變。針對病毒基因組中的相關部分進行DNA序列分析，鑑定耐藥相關突變，這有利於預測臨牀療效，並且可以爲闡述藥物的作用機制提供證據。應測定編碼目標蛋白的完整基因序列，對於導致病毒對所研究藥物耐藥的突變類型和導致病毒對其他同類藥物耐藥的突變類型進行比較。對於較大的病毒（如皰疹病毒、痘病毒），應對其基因組中與所研究藥物作用靶點相關的部分進行測序，並分析其中所含的與耐藥性產生相關的突變。建議在幾種遺傳背景（如毒株、亞型、基因型）中鑑定耐藥性產生的通路；通過選擇程序獲得的毒株如果同時出現了多種突變，則應該鑑定各種突變出現的先後順序。
進行基因型分析時，鼓勵申請人註明測序引物的序列，並說明這些引物可擴增出目標基因的鹼基數。還應說明用於檢測少數病毒亞羣的基因型檢測方法的靈敏度。闡明該突變在基因型分析中的比例和種類是十分重要的。
4.5.3 3.表型分析
表型分析用於確定變異株對藥物的敏感性是否降低。通過基因型分析鑑定出與耐藥性產生可能相關的突變後，如有可能，則應在重組病毒系統（即：使用定點突變技術，PCR擴增突變片段並導入實驗室標準株或使用其他適合的系統）中評價每一種突變導致表型耐藥的能力。通過體外試驗測定重組病毒對藥物的敏感性，並確定EC50值。計算突變株與對照株（生物學特性明確的野生型實驗室株）的EC50值之比（EC50值增加的倍數）。
任何標準的病毒學試驗方法都可用於計算病毒的表型耐藥的變化（如病毒相關蛋白檢測、PCR檢測病毒DNA或RNA、細胞病變檢測、MTT法檢測細胞毒性、報告基因表達檢測等）。通過測定突變株的EC50值，並與在相同條件下同時測得的對照株的EC50值進行比較，計算突變株敏感性的變化（耐藥性倍數的變化）。由於試驗中測得的EC50值比EC90或EC95值更精確，應優先使用EC50值。表型檢測方法的選擇取決於其靈敏度，即檢測耐藥株較對照株的敏感性變化（耐藥性的倍數）的能力。計算耐藥性的倍數（耐藥株的EC50值/參比株的EC50值）時，要求表型檢測方法之間具有可比性。
4.5.4 4.交叉耐藥性
使用針對相同靶點的抗病毒藥物治療時，對某一種藥物敏感性降低的變異，同時也可能會對相同靶點的其他藥物的敏感性降低或喪失，這種現象稱爲交叉耐藥。交叉耐藥並不一定是可以類推的，因此評價所有可能性非常重要。例如，如果病毒X對A藥和B藥耐藥，而病毒Y也對A藥耐藥，但病毒Y可能仍對B藥敏感。建議通過表型分析評價所研究藥物對同類的已上市藥物的耐藥毒株的有效性，同時評價同類已上市藥物對所研究藥物的耐藥毒株的有效性。此外，如果藥物的作用靶點相同，但結構類型不同[例如，核苷類逆轉錄酶抑制劑（NRTIs）和非核苷類逆轉錄酶抑制劑（NNRTIs），其作用的靶點都是HIV的逆轉錄酶]，則建議對不同類型的藥物進行交叉耐藥性分析。建議檢測多種耐藥株和臨牀分離病毒株對所研究藥物的表型敏感性（範圍應能代表已知可導致病毒對同類型藥物的敏感性降低的不同突變和突變的組合）。如果表型檢測是在病毒感染細胞系中進行的，則應該使用臨牀分離病毒株對EC50值進行校驗。
5 四、針對耐藥性產生的監測
應幫助醫生及患者瞭解抗病毒藥物的耐藥性信息，以協助其做出最佳的治療決策。除此之外，臨牀試驗方案設計和藥物研發計劃通常與藥物的耐藥性和交叉耐藥性情況密切相關。因此，強烈建議申請人根據藥物預期在臨牀上應用的實際情況，在藥物研發的各期臨牀試驗中進行全面的耐藥性監測。
對於某些病毒，病毒載量的變化可作爲判定抗病毒藥物臨牀療效的終點指標。在這種情況下，可以用測定病毒載量的方法進行耐藥性監測。基因型和表型檢測是考察耐藥病毒株是否出現的基礎，還有可能表明病毒的耐藥性與臨牀病毒學失敗之間的關係。此外，表型和基因型檢測結果還可用於指導治療方法的選擇，或預測藥物在某一患者個體的療效。對治療失敗或發生了病毒反彈的患者中分離到的病毒株進行基因型檢測可以發現導致病毒對所研究藥物敏感性降低的基因突變。此外，進行基線基因型和表型分析，可以根據基線病毒株的突變和多態性及表型敏感性判斷治療結果。如果病毒載量未被作爲主要終點指標，則建立檢測病毒載量的方法以及監測病毒耐藥性的出現對於分析病毒學指標與臨牀結果之間的關係將非常重要，而且有助於完善擬進行的臨牀試驗的設計。
建議申請人在開始以病毒感染的患者爲對象的臨牀試驗前，首先制訂耐藥性監測計劃，並作爲臨牀試驗方案的一部分。耐藥性監測計劃應至少包含下列內容：
· 採集用於檢測病毒載量、基因型和表型以及其他耐藥性分析樣本的時間點（如基線、第24周、第48周、治療失敗或中止試驗後）
建議申請人在藥物研發的早期階段即制訂基因型和表型耐藥的基線研究以及有關耐藥性子課題的計劃。申請人應及時完成有關基線耐藥和治療後分離病毒株的基因型和表型分析，以便明確所研究藥物的耐藥性特徵以及與其他藥物的交叉耐藥情況。對於HBV和HCV等病毒，監測基線和治療後病毒的基因型耐藥對評估耐藥突變的發生至關重要。通過比較分析治療失敗患者的樣本和基線樣本基因型，可以發現與耐藥性相關的突變。試驗方案中應明確說明病毒學失敗和中止研究的定義。
對於以經治患者爲對象的臨牀試驗，強烈建議申請人收集全部患者研究初始的基線分離病毒株的表型和基因型數據，同時收集所有病毒學失敗和退出研究（病毒複製未得到抑制）等終點時的表型和基因型數據。並注意應在患者仍在服用所研究藥物時完成樣本採集。
在以初治患者爲對象的臨牀試驗中，應設法獲得來自於所有病毒學失敗和中止研究（病毒複製尚未得到抑制）的患者的基線分離病毒株和終點分離病毒株的表型和基因型數據。在以未接受過治療的患者爲對象的研究中，應收集並保存所有患者的基線時的生物樣本，以備在病毒學失敗時進行表型和基因型分析。
根據臨牀試驗方案或研究人羣的具體情況，有時可能需要進行額外的基因型和表型評價或亞組分析，因此在臨牀試驗的各個階段（基線及治療階段）採集並保存樣本是非常必要的。申請人有時會提出當體外數據提示病毒在單一突變後導致高度表型耐藥時，在基線和病毒學失敗時收集初治患者亞組的樣本。對這樣的研究方案事先應進行討論。
申請人可以選擇自己進行病毒載量的檢測和表型及基因型耐藥性分析，也可以將生物樣本委託給其他有資質的實驗室進行檢測。實驗室樣品的處理應按照合適的操作程序進行。如果某項試驗未按照生產廠家的技術規範操作，則該試驗的結果可能不會被接受。鼓勵申請人使用經過鑑定和驗證的試驗方法。如果使用的檢測方法屬於研究性的，則建議申請人提供該檢測方法的操作特性參數（如準確性、精密度、檢測限及定量限、特異性、線性、檢測範圍、耐受性、穩定性），同時應描述病毒來源（如血液、血漿）、保存條件及穩定性、細胞培養程序。與用於鑑定藥物的抗病毒活性及耐藥性的探索性檢測方法相比，臨牀實踐中使用的檢測方法需要經過更加全面的驗證。研究者使用的常規商業檢測方法應該經過鑑定，但可能不需要提供方法學參數。申請人應就某一檢測方法需要校驗的次數和性質以及相關的方法學參數[如數據主控文檔（DMF）]與審評人員進行討論。建議申請人在III期臨牀試驗中進行特定的分析或測量時使用一致的檢測方法，對特定患者的分析檢測方法應在試驗期間保持不變。如果在藥物研發期間使用了任何新的檢測方法，應提供支持這種新檢測方法的相關數據。
6 五、病毒學研究報告
完整的病毒學研究報告內容比較廣泛，應包含原始數據和相關衍生數據、獲得數據的程序和評價數據所需的信息。病毒學研究報告中應包含藥物的非臨牀研究及臨牀抗病毒活性信息、接受過治療的患者的耐藥信息、與同類藥物的交叉耐藥的信息、基線基因型和表型病毒學應答分析。
病毒學研究報告的格式通常應包含下列部分： 概要、引言、材料與方法、結果及討論。在方法部分應描述使用的全部試驗方法，同時應對使用的統計分析方法進行描述。
7 六、總結
本指導原則介紹了抗病毒藥物研發和申請審評相關的病毒學研究項目，目的在於使對抗病毒藥物的分析更加全面。這種分析有助於提供支持藥物應用於人體的數據，同時還有助於確定量效關係、設計臨牀試驗、選擇合適的患者人羣。因此，這些研究數據會對藥物的治療成功率產生影響。
體外非臨牀病毒學研究能爲體內試驗的設計提供有用的信息，而且有助於預測體內試驗中耐藥株的產生，所以在開始I期臨牀試驗前須先進行非臨牀研究。開展以感染某種病毒的患者爲研究對象的臨牀試驗前，應詳細分析體外試驗中選擇到的耐藥病毒株。本指導原則還就如何及何時進行病毒學研究提出了建議。這些信息可以寫入產品介紹中，以便臨牀醫生正確開具抗病毒藥物處方，同時使治療成功率達到最大。
由於臨牀治療的需求，抗病毒藥的研發已成爲新藥開發的關注點。同時，病毒學研究的經驗逐漸積累，研究水平亦在不斷提高。建議申請人在開展抗病毒藥物的病毒學研究時關注本指導原則中提及的要素，同時鼓勵申請人就新藥臨牀前和臨牀病毒學研究的相關問題與審評機構進行討論和溝通。