3 凍幹皮上劃痕人用布氏菌病活菌苗製造及檢定規程
3.1 菌種
1.1 用弱毒牛型104M菌種。菌種應由中國藥品生物製品檢定所分發或經同意。
1.5 菌種檢定
1.5.1 培養特性
在含有1∶50000鹼性復紅培養基上應生長，但在含有同樣濃度的硫堇培養基上不應生長（亦可用紙片法檢查），在肝瓊脂斜面培養基上產生微量硫化氫。塗片鏡檢應爲革蘭氏陰性球桿菌。
用生理鹽水將新鮮培養物製成含菌數爲25億～30億/ml的菌懸液，置90℃水浴中30分鐘，不應出現凝集現象。用同樣濃度的菌懸液，與1∶1000三勝黃素水溶液等量混合，於37℃放24小時，不應出現凝集現象。用結晶紫菌落染色法檢查，菌落變異率不得超過3%。
將菌種接種於肝瓊脂平皿上，滴加布氏菌Tb噬菌體1滴，於37℃培育44～48小時，在噬菌體流過的地方應無本菌生長。
1.5.4 血清學試驗
用生理鹽水將新鮮培養物製成含菌數爲50億/ml的菌懸液，與已知效價的布氏菌診斷血清作凝集反應，其凝集價應達到血清原效價。
用生理鹽水將37℃培育44～48小時之肝瓊脂斜面新鮮培養物製成菌懸液，並稀釋成15億/ml、30億/ml、60億/ml、120億/ml和240億/ml等5個濃度的菌懸液。取體重18～20g小白鼠25只分爲5組，各組分別用不同濃度的菌懸液腹腔注射，每隻0.5ml，觀察7天，計算LD50，其值應爲10～20億菌。
1.5.6 免疫力試驗
用生理鹽水將菌種1代新鮮培養物製成濃度爲2億/ml的菌懸液。取體重300～350g豚鼠10只。每隻皮下注射1ml，經25～30天后，每隻豚鼠皮下攻擊羊型強毒布氏菌10個或20個感染量（MID）。同時取3組健康豚鼠作對照，每組3只，分別於各組豚鼠皮下注射0.5、1及2個MID。免疫及對照豚鼠於注射毒菌懸液後均觀察25～30天后解剖，取出鼠蹊部淋巴結、腹主動脈旁淋巴結、肝及脾分別接種肝瓊脂中管斜面培養基，於37℃培育10天。如免疫動物組織之培養物有布氏菌生長，應用硫堇染科培養基（亦可用紙片法）和硫化氫反應做菌型鑑別試驗。注射1個MID的3只對照豚鼠都必須發生全身感染，即肝臟或脾臟應分離出羊型毒菌。免疫組攻擊10個MID時， 10只豚鼠中不應有2只以上分離出羊型毒菌；攻擊20個MID時，10只豚鼠中不應有3只以上分離出羊型毒菌。
3.2 菌苗製造
2.1 製造菌苗的工作室應專用，不得與其他細菌工作混用。生產中應嚴格執行無菌操作，非製造菌苗用的其他布氏菌不得帶到生產工作室內。
2.2 製造菌苗可用pH6.6～7.2的肝浸液瓊脂或其他適宜培養基。
2.3 啓開凍幹菌種，接種在肝瓊脂斜面或其他適宜的培養基上，放37℃培育44～48小時爲第1代。第1代菌須進行1∶500三勝黃素玻片凝集試驗，只有光滑型菌方可用於製造菌苗。第1代菌種斜面於2～8℃可保存15日。
2.4 將第1代菌種接種到肝瓊脂或其他適宜培養基上，放37℃培育44～48小時爲第2代菌種。經肉眼純菌檢查合格後，棄去凝固水，用無菌生理鹽水製成菌懸液。
2.5 將第2代菌種接種到瓊脂或其他適宜培養基上，放37℃培育44～48小時，肉眼逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。
2.6 用含有蔗糖、明膠、硫脲和味精組成的保護液或其他適宜的保護液洗下菌苔或刮取菌苔，放入保護液內。每數瓶培養物可採入或刮入1瓶（或1大管）保護液內，此爲菌苗原液，置2～8℃保存。每瓶（或大管）原液均按《生物製品無菌試驗規程》進行純菌試驗。
2.7 將純菌試驗合格的原液合併，如每安瓿凍幹菌苗爲10人份，裝量0.5ml原液，則應合併後的原液稀釋成每ml含菌1800億～2000億，使每1人份菌苗含90億～100億。由原液採集到冷凍乾燥之間隔不得超過7天。稀釋後的原液經純菌試驗合格後即可分裝安瓿凍幹。
2.8 同一日採集的原液同一次凍幹者爲1批。如1批有數瓶，應分爲亞批。
3.3 冷凍乾燥
菌苗原液分裝安瓿完畢後應立即在-30℃以下進行冷凍。乾燥時間可根據水分含量及活菌數來決定。乾燥完畢後進行真空封口。亦可用充氮封口。
3.4 成品檢定
凍幹菌苗應爲乳白色疏鬆體，加入生理鹽水後，應於1分鐘內溶解成均勻懸液。用真空測定器檢查安瓿應爲真空。水分含量不得超過3%。
4.2 菌型檢查
每亞批菌苗應用硫堇培養基或紙片法及硫化氫反應做菌型鑑別檢查，應呈牛型布氏菌的培養特性。
4.3 純菌試驗
每亞批菌苗抽樣按《生物製品無菌試驗規程》進行。
每亞批取3支安瓿，加生理鹽水溶解混勻後比濁。將菌液濃度稀釋爲含菌10億/ml，再用生理鹽水做10倍系列稀釋至10-6，取10-6或其他適宜的稀釋度之菌液接種5個平皿，每個平皿接種0.1ml。用塗菌棒塗勻後放37℃培育4～5天，計算活菌數。凍幹後活菌率不得少於50%，如不合格可複試，經複試仍低於50%者則該批菌苗廢棄。同時用結晶此菌落染色法檢查，菌落變異率不得超過10%。
4.5 濃度測定
菌苗經溶解後，按中國細菌濁度標準測定濃度，每人份含菌數應爲90億～100億。
4.6 安全試驗
每亞批取3支安瓿，用生理鹽水溶解後混勻。用體重18～20g小白鼠5只，每隻皮下注射10億菌/ml的菌懸液0.5ml。觀察7日不應有死亡，如有死亡應複試一次，仍有死亡，則該批菌苗廢棄。
4.7 免疫力試驗
10批以下者至少抽1批進行免疫力試驗，10批以上者，每10批抽1批。用滅菌生理鹽水溶解凍幹菌苗，並稀釋成5億菌/ml菌懸液。取體重300～350g豚鼠10只，每隻皮下注射1ml。經25～30日後，每隻豚鼠皮下攻擊羊型線毒布氏菌10個或20個MID。同時用3組健康豚鼠作對照，每組3只，各組豚鼠分別於皮下注射0.5、1和2MID。各組不能自拔於注射毒菌懸液後25～30日解剖，取鼠蹊部淋巴結、腹主動脈旁淋巴結、肝及脾，分別接種肝瓊脂中管斜面培養基，於37℃培育10天。如免疫動物組織之培養物有布氏菌生長，需用硫堇培養基（亦可用紙片法）和硫化氫反應做菌型鑑別試驗。注射1個MID的3只對照豚鼠都必須發生全身感染，即肝臟或脾臟應分離出羊型毒菌。攻擊10個MID時，10只免疫豚鼠中不應有3只以上分離出羊型毒菌；攻擊20個MID時10只免疫豚鼠中不應有4只以上分離出羊型毒菌。
3.5 保存與效期
應保存於2～8℃暗處。自凍幹後活菌數檢定合格之日起效期爲1年。
4 凍幹皮上劃痕人用布氏菌病活菌苗作用介紹
嚴禁注射！
本品系採用布氏菌弱毒菌種，經培育後凍乾製成。用於預防布氏菌病。
本品爲乳白色疏鬆體，加入生理鹽水後，應於1分鐘內溶解成均勻懸液。
4.1 接種對象
凡與布氏菌病傳染源有密切接觸者，每年應免疫一次。布氏菌素反應陽性者可不予接種。
4.2 用法
1.使用前應仔細檢查安瓿，安瓿不應有裂紋。
2.菌苗按所載人份量加入滅菌生理鹽水溶解。每支安瓿10人份，加入0.5ml，溶解後之菌苗應3小時內用完。
3.上臂外側上部皮上劃痕接種。在接種處用酒精消毒，待幹後，滴上菌苗（每人份0.05ml），再用消毒針劃痕。10歲以下兒童及複種者菌苗滴於一處劃一個“井”字，10歲以上初種者菌苗滴於二處劃二個“井”字，間隔2～3cm，劃痕長度1～1.5cm，應以劃破表皮微見血跡爲宜。劃痕處用針塗壓10餘次，使菌液充分進入痕內。接種後局部應裸露至少5分鐘。
4.3 禁忌
2.妊娠期，前6個月授乳期。
4.4 反應
接種後局部反應輕微，少數人劃痕處會出現輕度浸潤，一般不影響勞動。個別人體溫稍有增高。如因使用途徑錯誤，出現類似急性布氏菌病症狀者，要按急性布菌病進行徹底治療。
4.5 注意事項
1.本品僅供皮上劃痕用，嚴禁注射。
2.安瓿有裂紋、標籤不清、製品過期失效者不可使用。
4.6 保存
保存於2～8℃暗處。
5 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》"．