3 註解
確定了蛋白之間的相互作用後， 更重要的工作是研究其功能、結構及其作用的條件調節。鑑定在相互作用的一對蛋白中的任一蛋白突變對其相互作用的抑制作用， 不僅有助於探索相互作用的結構單位， 而且可作爲研究體內功能的遺傳學方法。這對於多個作用分子的蛋白就更爲重要。 1996年Vidalix x等建立了反向酵母雙雜交系統(reverse two-hybrid system)， 提供了簡便的鑑定阻斷蛋白間相互作用的方法。反向酵母雙雜交系統的關鍵是摻入一種表達產物對細胞生長有毒的報導基因， 用於監測蛋白間的相互作用。例如酵母URA3基因表達產物是尿嘧啶合成所必需的， 同時它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)轉化爲有毒物質。Vidal等構建了一酵母細胞株， 其URA3的表達由含GAL4結合位點的啓動子嚴密控制。此細胞株在缺乏尿嘧啶的培養基中培育需要GAL4激活結構域(GAD)和GAL4 DNA結合結構域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表達。而在含5-FOA的完全培養基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通過篩選5-FOA抗性克隆從隨機突變庫中鑑定阻斷蛋白相互作用的突變體。
反向雙雜交系統可更有效地蛋白間作用的關鍵位點或起決定作用的個別氨基酸， 進而分析蛋白結構和功能的關係。此外此系統還可篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質用作臨牀治療製劑。