3 重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Chongzu Yixing Ganyan Yimiao （NiangjiuJiaomu）
3.1.3 英文名
Recombinant Hepatitis B Vaccine（Saccharomyces cerevisiae）
3.2 定義、組成及用途
本品系由重組釀酒酵母表達的乙型肝炎（簡稱乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）經純化，加入鋁佐劑製成。用於預防乙型肝炎。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 生產用菌種
3.4.1.1 2.1.1 名稱及來源
生產用菌種爲美國默克公司以DNA重組技術構建的表達HBsAg的重組釀酒酵母原始菌種，菌種號爲2150-2-3 （pHBS56-GAP347/33）。
3.4.1.2 2.1.2 種子批的建立
由美國默克公司提供的菌種經擴增1代爲主種子批，主種子批擴增1代爲工作種子批。
3.4.1.3 2.1.3 種子批菌種的檢定
3.4.1.3.1 2.1.3.1 培養物純度
培養物接種於哥倫比亞血瓊脂平板和酶化大豆蛋白瓊脂平板，分別於20～25℃和30～35℃培養5～7天，應無細菌和其他真菌被檢出。
3.4.1.3.2 2.1.3.2 HBsAg基因序列測定
3.4.1.3.3 2.1.3.3 質粒保有率
採用平板複製法檢測。將菌種接種到複合培養基上培養，得到的單個克隆菌落轉移到限制性培養基上培養，計算質粒保有率，應不低於95%。
式中PR爲質粒保有率，%；
A+L爲在含腺嘌呤和亮氨酸的基本培養基上生長的菌落數，CFU/皿。
3.4.1.3.4 2.1.3.4 活菌率
採用血細胞計數板，分別計算每1ml培養物中總菌數和活菌數，活菌率應不低於50%。
3.4.1.3.5 2.1.3.5 抗原表達率
取種子批菌種擴增培養，採用適宜的方法將培養後的細胞破碎，測定破碎液的蛋白質含量（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B第二法），並採用酶聯免疫法或其他適宜方法測定HBsAg含量。抗原表達率應不低於0.5%。
3.4.1.4 2.1.4 菌種保存
主種子批和工作種子批菌種應於液氮中保存，工作種子批菌種予-70℃保存應不超過6個月。
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 發酵
取工作種子批菌種，於適宜溫度和時間經錐形瓶、種子罐和生產罐進行三級發酵，收穫的酵母菌應冷凍保存。
3.4.2.2 2.2.2 培養物檢定
3.4.2.2.1 2.2.2.1 培養物純度
按2.1.3.1項進行。
3.4.2.2.2 2.2.2.2 質粒保有率
按2.1.3.3項進行，應不低於90%。
3.4.2.3 2.2.3 培養物保存
於-60℃以下保存不超過6個月。
3.4.2.4 2.2.4 純化
用細胞破碎器破碎釀酒酵母，除去細胞碎片，以硅膠吸附法粗提HBsAg，疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處理，經稀釋和除菌過濾後即爲原液。
3.4.2.5 2.2.5 原液檢定
按3.1項進行。
3.4.2.6 2.2.6 原液保存
於2～8℃保存不超過3個月。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 甲醛處理
原液中按終濃度爲100μg/ml加入甲醛，於37℃保溫適宜時間。
3.4.3.2 2.3.2 鋁吸附
每1μg蛋白質和鋁劑按一定比例置2～8℃吸附適宜的時間，用無菌生理氯化鈉溶液洗滌，去上清液後再恢復至原體積，即爲鋁吸附產物。
3.4.3.3 2.3.3 配製
蛋白質濃度爲20.0～27.0μg/ml的鋁吸附產物可與鋁佐劑等量混合後，即爲半成品。
3.4.3.4 2.3.4 半成品檢定
按3.2項進行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分裝
3.4.4.3 2.4.3 規格
每瓶0.5ml或1.0ml。每1次人用劑量0.5ml，含HBsAg 5μg或10μg;或每1次人甩劑量1.0ml，含HBsAg 10μg。
3.4.4.4 2.4.4 包裝
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 原液檢定
3.5.1.1 3.1.1 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.1.2 3.1.2 蛋白質含量
應爲20.0～27.0μg/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B第二法）。
3.5.1.3 3.1.3 特異蛋白帶
採用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（2010年版藥典三部附錄ⅣC），分離膠膠濃度爲15%，上樣量爲1.0μg，銀染法染色。應有分子質量爲20～25kD蛋白帶，可有HBsAg多聚體蛋白帶。
3.5.1.4 3.1.4 N端氨基酸序列測定（每年至少測定1次）
用氨基酸序列分析儀測定，N端氨基酸序列應爲：Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu。
3.5.1.5 3.1.5 純度
採用免疫印跡法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅷ A），所測供試品中酵母雜蛋白應符合批准的要求；採用高效液相色譜法（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B），親水硅膠高效體積排阻色譜柱；排阻極限1000kD;孔徑45nm,流動相爲含0.05%疊氮鈉和0.1% SDS的磷酸鹽緩衝液（pH7.0）；上樣量100μl;檢測波長280nm。按面積歸一法計算P60蛋白質含量，雜蛋白應不高於1.0%。
3.5.1.6 3.1.6 細菌內毒素檢查
應小於10EU/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.2 3.2 半成品檢定
3.5.2.1 3.2.1 吸附完全性
將供試品於6500g離心5分鐘取上清波，依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅹ A）參考品、供試品及其上清液中HBsAg含量。以參考品HBsAg含量的對數對其相應吸光度對數作直線迴歸，相關係數應不低於0.99，將供試品及其上清液的吸光度值代入直線迴歸方程，計算其HBsAg含量，再按下式計算吸附率，應不低於95%。
式中P爲吸附率，%
cs爲供試品上清液的HBsAg含量，μg/ml
ct爲供試品的HBsAg含量，μg/ml。
3.5.2.2 3.2.2 化學檢定
3.5.2.2.1 3.2.2.1 硫氰酸鹽含量
將供試品於6500g離心5分鐘，取上清液。分別取含量爲1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml的硫氰酸鹽標準溶液、供試品上清液、生理氯化鈉溶液各5.0ml於試管中，每一供試品取2份，在每管中依次加入硼酸鹽緩衝液（pH9.2）0.5ml，2.25%氯胺T-0.9%氯化鈉溶液0.5ml，50%吡啶溶液（用生理氯化鈉溶液配製）1.0ml，每加一種溶液後立即混勻，加完上述溶液後靜置10分鐘，以生理氯化鈉溶液爲空白對照，在波長415nm處測定各管吸光度。以標準溶液中硫氰酸鹽的含量對其吸光度均值作直線迴歸，計算相關係數，應不低於0.99，將供試品上清液的吸光度均值代入直線迴歸方程，計算硫氰酸鹽含量，應小於1.0μg/ml。
3.5.2.2.2 3.2.2.2 Triton X-100含量
將供試品於6500g離心5分鐘，取上清液。分別取含量爲5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的Triton X-100標準溶液、供試品上清液、生理氯化鈉溶液各2.0ml於試管中，每一供試品取2份，每管分別加入5% （ml/ml）苯酚溶液1.0ml，迅速振盪，室溫放置15分鐘。以生理氯化鈉溶液爲空白對照，在波長340nm處測定各管吸光度。以標準溶液中Triton X-100的含量對其吸光度均值作直線迴歸，計算相關係數，應不低於0.99，將供試品上清液的吸光度均值代入直線迴歸方程，計算Triton X-100含量，應小於15.0μg/ml。
3.5.2.2.3 3.2.2.3 pH值
應爲5.5～7.2（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.5.2.2.4 3.2.2.4 遊離甲醛含量
應小於20μg/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅵ L）。
3.5.2.2.5 3.2.2.5 鋁含量
應爲0.35～0.62mg/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅶ F）。
3.5.2.2.6 3.2.2.6 滲透壓摩爾濃度
應爲280mOsmol/kg±65mOsmol/kg（2010年版藥典三部附錄Ⅴ H）。
3.5.2.3 3.2.3 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.2.4 3.2.4 細菌內毒素檢查
應小於5EU/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.3 3.3 成品檢定
3.5.3.1 3.3.1 鑑別試驗
3.5.3.2 3.3.2 外觀
應爲乳白色混懸液體，可因沉澱而分層，易搖散，不應有搖不散的塊狀物。
3.5.3.3 3.3.3 裝量
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ A），應不低於標示量。
3.5.3.4 3.3.4 化學檢定
3.5.3.4.1 3.3.4.1 pH值
應爲5.5～7.2（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.5.3.4.2 3.3.4.2 鋁含量
應爲0.35～0.62mg/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅶ F）。
3.5.3.5 3.3.5 體外相對效力測定
應不低於0.5（2010年版藥典三部附錄Ⅹ A）。
3.5.3.6 3.3.6 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.3.7 3.3.7 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F），應符合規定。
3.5.3.8 3.3.8 細菌內毒素檢查
應小於5EU/ml（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.6 4 保存、運輸及有效期
3.7 5 使用說明
【藥品名稱】
通用名稱：重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）
英文名稱：Recombinant Hepatitis B Vaccine（Saccharomyces cerevisciae）
漢語拼音：Chongzu Yixing Ganyon Yimiao （Niangjiu Jiaomu）
【成分和性狀】
本品系由重組釀酒酵母表達的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）經純化，加入鋁佐劑製成。爲乳白色混懸液體，可因沉澱而分層，易搖散，不含任何防腐劑。
【接種對象】
（1）新生兒，特別是母親爲HBsAg、HBeAg陽性者。
（2）從事醫療工作的醫護人員及接觸血液的實驗人員。
【作用與用途】
接種本疫苗後，可刺激機體產生抗乙型肝炎病毒的免疫力。用於預防乙型肝炎。
【規格】
每瓶0.5ml或1.0ml。每1次人用劑量0.5ml，含HBsAg 5μg或10μg;或每1次人用劑量1.0ml，含HBsAg 10μg。
（1）於上臂三角肌肌內注射。
（2）基礎免疫程序爲3針，分別在0、1、6月接種。新生兒第1針在出生後24小時內注射。16歲以下人羣每1次劑量爲5μg，16歲或以上人羣每1次劑量爲10μg。
【不良反應】
常見不良反應：
一般接種疫苗後24小時內，在注射部位可出現疼痛和觸痛，多數情況下於2～3天內自行消失。
罕見不良反應：
（1）一般接種疫苗後72小時內，可能出現一過性發熱反應，一般持續1～2天后可自行緩解。
（2）接種部位輕、中度的紅腫、疼痛，一般持續1～2天后可自行緩解，不需處理。
（3）接種部位可出現硬結，一般1～2個月可自行吸收。
極罕見不良反應：
（1）局部無菌性化膿：一般要用注射器反覆抽出膿液，嚴重時（如出現破潰）需擴創清除壞死組織，病時較長，最後可吸收癒合。
（2）過敏反應：過敏性皮疹、阿瑟反應。阿瑟反應一般出現在接種後10天左右，局部紅腫持續時長，可用固醇類藥物進行全身和局部治療。
（3）過敏性休克：一般在接種疫苗後1小時內發生，應及時注射腎上腺素等搶救措施進行治療。
【禁忌】
（2）患急性疾病、嚴重慢性疾病、慢性疾病的急性發作期和發熱者。
（3）妊娠期婦女。
【注意事項】
（1）以下情況者慎用：家族和個人有驚厥史者、患慢性疾病者、有癲癇史者、過敏體質者。
（2）使用時應充分搖勻，如疫苗瓶有裂紋、標籤不清或失效者、疫苗瓶內有異物者均不得使用。
（3）疫苗瓶開啓後應立即使用，。
（4）應備有腎上腺素等藥物，以備偶有發生嚴重過敏反應時急救用。接受注射者在注射後應在現場觀察至少30分鐘。
（5）注射第1針後出現高熱、驚厥等異常情況者，一般不再注射第2針。對於母嬰阻斷的嬰兒，如注射第2、3針應遵照醫囑。
（6）嚴禁凍結。
【貯藏】
於2～8℃避光保存和運輸。
【包裝】
按批准的執行。
【有效期】
36個月。
【執行標準】
【批准文號】
【生產企業】
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3.8 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版