3 註解
免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）亦稱酶聯免疫電轉移印斑法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB），因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法Southernblot相類似，亦被稱爲Westernblot。免疫印跡法（圖15-12）分三個階段進行。第一階段爲SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白樣品經SDS處理後帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色後才顯出電泳區帶）。第二階段爲電轉移。將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉移即可完成。此分階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見。第三階段爲酶免疫定位。將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當於包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用後，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。常用的HRP底物爲3，3＇-二氨基聯苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽性反應的條帶清晰可辨，並可根據SDA-PAGE加入的分子量標準，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應用於分析抗原組分及其免疫活性，並可用於疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作爲確診試驗。抗原經電泳轉移在硝酸纖維素膜上後，將膜切成小條，配合酶標抗體及顯色底物製成的試劑盒可方便地在實驗室中供檢測用。根據出現顯色線條的位置可判斷有無針對病毒的特異性抗體。
圖15-12 免疫印跡法原理示意圖