1 拼音
xuè yè zhì pǐn qù chú ／miè huó bìng dú jì shù fāng fǎ jí yàn zhèng zhǐ dǎo yuán zé
《血液製品去除／滅活病毒技術方法及驗證指導原則》由國家食品藥品監督管理局於2002年5月9日國藥監注[2002]160號印發。
目前已知經血液製品傳染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和細小病毒B19。尚未發現經血液製品傳染CJD。但有少數研究報告發現有實驗性傳染現象，因此要密切關注CJD，特別是vCJD的發展動向。
爲了提高血液製品安全性，生產工藝要具有一定的去除/滅活部分病毒能力，生產過程中應有特定的去除/滅活病毒方法。本技術指導原則是對血液製品（指以人血漿爲原料製備的製品）生產過程以及特定的去除/滅活病毒方法驗證的指導原則，包括指示病毒和病毒去除/滅活方法的選擇、驗證方案的設計、結果判定以及附錄所列技術驗證申報的程序。
2 一、去除/滅活病毒方法的選擇
由於不同類血液製品潛在的污染病毒的可能性不同，爲此選擇病毒去除/滅活方法的側重點也應有所不同：
2.1 （一）凝血因子類製品
生產過程中應有特定的能去除/滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可採用一種或多種方法聯合去除/滅活病毒。
2.2 （二）免疫球蛋白類製品
對於免疫球蛋白類製品（包括靜脈注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特異性人免疫球蛋白）生產過程中應有特定的滅活脂包膜病毒方法。但從進一步提高這類製品安全性考慮，提倡生產過程中加入特定的針對非脂包膜病毒的去除/滅活方法。
2.3 （三）白蛋白
3 二、常用的去除/滅活病毒方法評價
3.1 （一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）
3.1.1 1．人血白蛋白製品
幾十年臨牀應用結果表明，白蛋白的巴氏消毒法對HIV和肝炎病毒是安全的。其病毒滅活條件已很完善，可不要求進行病毒滅活驗證。但是必須對巴氏消毒法所用設施進行驗證，使巴氏消毒各參數符合要求（包括製品內溫度分佈的均一性和滅活時間）。
3.1.2 2．其它血液製品（液體制劑）
由於製品的組成、穩定劑（如：氨基酸、糖、枸櫞酸鹽等）及其濃度的不同，均會對滅活病毒效果有一定的影響。因此在採用巴氏消毒滅活病毒方法時必須進行病毒滅活效果驗證。
3.2 （二）乾熱法（凍乾製品）
80℃加熱72小時，可以滅活HBV、HCV、HIV和HAV等病毒。但應考慮製品的水分含量、製品組成（如：蛋白質、糖、鹽和氨基酸）對病毒滅活效果的影響。應確定允許的製品瓶間各參數的差異。病毒滅活用的乾熱箱至少每半年驗證一次。驗證時乾燥箱內應設多個測溫點（包括製品內、箱內最高和最低溫度點）。
3.3 （三）有機溶劑/去污劑（S/D）處理法
有機溶劑，如：磷酸三丁脂（TNBP）和非離子化的去污劑，如：Triton X-100或吐溫-80結合可以滅活脂包膜病毒，但對非脂包膜病毒無效。常用的滅活條件是0.3%TNBP和1%吐溫-80，在24℃處理至少6小時；0.3%TNBP和1%Triton X-100，在24℃處理至少4小時。S/D處理前應先用1μm濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒（顆粒可能藏匿病毒從而影響病毒滅活效果）。加入S/D後應確保是均一的混合物。在滅活病毒全過程中應將溫度控制在規定的範圍內。如果在加入S/D後過濾，則須檢測過濾後S/D的濃度是否發生變化，如有變化應進行適當調整。吐溫-80應採用植物源性，並應採用稱量法量取。
3.4 （四）膜過濾法
膜過濾技術只有在濾膜的孔徑比病毒有效直徑小時纔能有效除去病毒。該方法不能單獨使用，應與其它方法聯合使用。
驗證研究時應考慮蛋白溶液的濃度、濾速、壓力和過濾量等重要參數。在過濾前及過濾後應測試濾膜的完整性。
3.5 （五）低pH孵放法
研究表明，免疫球蛋白生產工藝中的低pH（如pH4）處理（有時加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。滅活條件（如：pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、蛋白質濃度、溶質含量等因素）可能影響病毒滅活效果，驗證試驗應該研究這些參數允許變化的幅度。
4 三、特定的去除/滅活病毒方法驗證
4.1 （一）指示病毒的選擇
首先，應該選擇經血液傳播的相關病毒（如：HIV），不能用相關病毒的，要選擇與其理化性質儘可能相似的指示病毒；第二，所選擇的病毒理化性質應有代表性（病毒大小、核酸類型以及有無包膜），其中至少應包括一種對物理和/或化學處理有明顯抗性的病毒。在進行去除/滅活病毒驗證時，應根據製品的特性及所採用的病毒去除/滅活工藝，參照下表列舉的病毒選擇適宜的指示病毒。所選擇的指示病毒至少應包括HIV-1、HBV和HCV模擬病毒以及非脂包膜病毒。水皰性口炎病毒（VSV）耐受的pH範圍比較廣，驗證低pH孵放法滅活病毒效果時可選用此指示病毒。
| 病毒 | 基因組 | 脂包膜 | 大小（nrn） | 指示病毒舉例 |
| HIV | RNA | 有 | 80-100 | HIV |
| HBV | DNA | 有 | 45 | 鴨乙型肝炎病毒、僞狂犬病毒 |
| HCV | RNA | 有 | 40-60 | 牛腹瀉病毒、Sindbis病毒 |
| HAV | RNA | 無 | 27 | HAV、脊髓灰質炎病毒、腦心肌炎（EMC）病毒 |
| B19 | DNA | 無 | 20 | 犬細小病毒、豬細小病毒 |
4.2 （二）方案設計
2．研究影響去除/滅活病毒效果的參數（包括機械參數和理化參數）允許變化的幅度。
6．如可能，驗證過程中每步取出的樣品應儘快直接進行病毒滴定，不做進一步處理（如超離心、透析或保存、除去抑制劑或毒性物質等）。如果樣品必須做進一步處理，或不同時間取出的樣品要在同一時間進行測定，應考慮這些處理方法對病毒檢測結果的影響。
7．檢測方法可包括蝕斑形成、細胞病變（如合胞體或病竈形成）、終點滴定或其他方法。這些方法應該有適宜的靈敏度和可重複性，每一個取樣點應取雙份樣品並設有對照以保證結果的準確性。
8．如果製品的生產工藝中包含了兩步或兩步以上病毒去除/滅活方法，應該分別進行病毒滅活效果驗證。
4.3 （三）觀察指標
4.3.1 1．病毒方面
（2）滅活病毒速率、滅活曲線。以列表和做圖形式報告驗證結果。
4.3.2 2．病毒去除/滅活各參數允許變化範圍
4.3.3 3．蛋白質方面
（2）採用適當方法測定蛋白質結構和功能活性的變化。如：製品比活性、IVIG的Fc功能分析可瞭解蛋白質結構是否發生了變化；凝膠色譜法可檢測蛋白質分子大小和形狀的變化；蛋白質形狀變化可導致擴散係數、沉降常數和粘度的改變；SDS-PAGE，特別是等電聚焦和PAGE結合（雙向電泳）也是檢測蛋白質結構變化的很好方法。
（3）如果採用新的去除/滅活方法（包括更換使用已認可的病毒滅活方法或國內外未曾採用過的病毒去除/滅活方法），需對蛋白質半衰期和新免疫原性進行研究。要求如下：
半衰期：用適宜動物（如大鼠或家兔）和未經病毒去除/滅活的相同製品進行半衰期比較；新免疫原性：新免疫原性用來檢查蛋白質較高級別結構上的變化。這些變化不一定損害蛋白質功能，但是會引起受體免疫反應。實驗室檢測新免疫原性是非常困難的。可用經和未經病毒滅活的蛋白分別免疫動物（如家兔），所產生的抗體交叉用未經和經病毒滅活的蛋白結合。如果經病毒滅活的蛋白抗體被未經病毒滅活的蛋白完全結合，說明不含新抗原。由於不能保證人類免疫系統識別的表位與實驗動物相同，因此推薦在Ⅳ期臨牀（獲得生產文號後）開展是否有新抗原產生的研究。
4.4 （四）效果的判定
判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來確定。在確定有效之前，必須考慮如下因素，審慎評價每次驗證結果。
2．病毒降低量（log10）≥4 logs，表示該步驟去除/滅活病毒有效。如因檢測方法造成病毒降低量＜4 logs時，應盲傳三代，如無病毒檢出，可認定是有效的滅活病毒方法。
3．病毒滅活動力學可更好的顯示病毒滅活的效果。病毒滅活通常不是簡單的一級反應。往往是起始反應速率快，其後變慢。如果病毒滅活速率隨時間明顯降低，表示該方法可能無效，或者殘留的指示病毒對該滅活方法有抵抗力，說明該步病毒滅活方法無效。
4．病毒實際滴度爲基礎病毒，指示病毒與樣品1:9的比例混勻後零點取樣的病毒滴度，通過與經去除/滅活病毒後的測定的實際病毒殘留量的比較，作爲該病毒去除/滅活方法（步驟）實際的滅活病毒的量。
舉例說明：
（1）加入6 logs 病毒，剩餘4 logs 病毒，可將去除/滅活病毒的log數計算在生產全過程中去除/滅活病毒總量之中，但是就此步（方法）去除/滅活病毒能力而言是無效的。
（2）加入6 logs 病毒，但由於製品本身的細胞毒作用使得檢測靈敏度限值爲4 logs ，僅證明除去2 logs 的病毒。在此種情況下需改變試驗設計重新進行驗證。
（3）加入6 logs 病毒，但仍可測定2 logs 的剩餘病毒，且清除病毒的量可重複出，並不受工藝的影響，應認爲是有效的去除/滅活病毒的方法。
（4）加入 6 logs病毒 ，之後未檢測出病毒。但是由於檢測靈敏度限值爲2 logs ，僅能認爲大約清除或滅活了4 logs 病毒。事實上可能等於或大於4 logs ，因此應判定此方法清除的病毒量≥4 logs。
（5）病毒滅活動力學是非常重要的觀察指標。如巴氏消毒法（60℃，10小時），如果病毒殘留量很快降到最低檢出限度值，說明此方法滅活病毒效果很好。如果病毒滅活速率緩慢，在滅活結束時才達到最低檢出限度值，不能認爲是一個有效的病毒滅活方法。這就是說，評價驗證結果不能僅考慮病毒降低量，同時也要考慮病毒滅活動力學。
5 四、生產工藝去除/滅活病毒能力的驗證
生產工藝去除/滅活病毒能力驗證參照特定的去除/滅活病毒方法驗證的要求進行。需要特殊考慮的問題有以下幾方面：
（二）模擬的生產工藝各種參數應儘可能與實際的生產工藝相一致，如pH、溫度、蛋白質和其他組成成分的濃度、反應時間、層析柱的柱牀高度及流速與牀高的比例、洗脫圖譜及該步驟的生產效果（如產量、比活性、組成成分）。應分析生產工藝中各種參數的偏差對病毒去除/滅活效果的影響。
（四）核酸擴增技術（如PCR）檢測病毒核酸的靈敏度比較高，但是該檢測技術最大的侷限性是不能區別被滅活了還是未被滅活的病毒。因此該技術不能用於滅活病毒量的驗證，只能用於生產過程中病毒去除量的驗證。
（五）通常在生產過程中去除/滅活病毒量是可以計算在清除病毒總量中，但不能認定是有效病毒去除步驟。因爲生產過程通常有一些變化，很難控制及驗證，而且，病毒分配完全取決於病毒特異的理化性質，這些理化性質影響了病毒與凝膠介質相互作用和沉澱的性質。因此由於病毒表面特性的微小差異（如：糖基化），指示病毒與靶病毒分配形式可能完全不同。在實驗室增殖的相關病毒可能在分配上與野生株不同。然而，如果病毒降低量可重複，如果影響病毒分配的各生產參數可以適當地確定和控制，所要的組份能可靠的與一般公認的含病毒組份分開，就可以符合有效步驟的標準（即，認爲是有效去除/滅活病毒步驟）。
（六）驗證的目的是爲了確定生產工藝去除/滅活病毒的能力，獲得生產全過程中估計去除/滅活病毒的總量。一般降低的總量是各步降低病毒量的總和。但是由於病毒驗證的侷限性，如分步驟中病毒降低量≤1 log則不應將其計算在總量中。
6 五、去除/滅活病毒方法的再驗證
（一）首次生產者，需對生產工藝中特定的去除/滅活病毒方法進行再驗證；
（二）採用新工藝或對原有生產工藝進行了重大改革時，需對生產工藝進行清除病毒能力驗證；對特定的去除/滅活病毒方法進行去除/滅活病毒效果驗證；
7 附錄：血液製品病毒去除/滅活驗證申報程序
1、國家藥品監督管理局授權中國藥品生物製品檢定所及其它認定的檢測實驗室進行病毒去除/滅活效果的驗證工作。
2、血液製品生產企業應按本技術指導原則的要求對其生產工藝和特定的病毒去除/滅
活方法進行驗證。如無條件，可委託其它單位進行去除/滅活病毒效果的驗證。
3、血液製品生產企業在完成去除/滅活病毒效果驗證後，向中國藥品生物製品檢定所提出驗證申請，並附製品生產工藝、質量標準、病毒滅活方法及其標準操作細則（SOP）、至少中試規模連續生產的三批病毒滅活前中間品（去除/滅活病毒前的樣品）及其製造記錄等相關資料。
4、中國藥品生物製品檢定所對生產單位提交的驗證申請及相關的技術資料進行審覈；對其提供的三批病毒滅活前的中間品進行與病毒去除/滅活方法相關的參數（如：pH、蛋白質濃度、水分及穩定劑含量、純度等）的檢測。
5、中國藥品生物製品檢定所及授權認定的檢測實驗室對生產單位提交的連續生產的三批病毒滅活前的中間品進行病毒滅活方法效果驗證。授權認定的檢測實驗室在驗證完成後將驗證結果函告中國藥品生物製品檢定所。
6、在病毒去除/滅活驗證的同時或驗證後，中國藥品生物製品檢定所對申報單位提供的連續生產的三批製品（批號可與病毒驗證時報送的製品的批號不同，但必須是採用相同的生產工藝和病毒去除/滅活方法生產的製品）進行全面質量複覈（按《中國生物製品規程》及有關的法定標準進行全檢，出具檢驗報告）。
7、採用新的病毒去除/滅活方法時，在資料審查及病毒滅活效果驗證結束後，由中國藥品生物製品檢定所負責組織血液製品和病毒學等方面專家以及包括藥品審評中心在內的相關部門的人員參加的技術論證會，對申報的病毒滅活方法進行論證。
8、驗證結束後，中國藥品生物製品檢定所將去除/滅活病毒驗證結果、綜合評價意見及三批製品檢定報告回覆申報單位；
9、申報單位將申報血液製品擬採用的病毒去除/滅活方法研究資料（包括相關文獻）、企業自檢報告和中國藥品生物製品檢定所及授權認定的檢測實驗室向生產單位提交的病毒去除/滅活方法驗證結果、綜合評價或論證意見、加入病毒去除/滅活工藝後的製品穩定性考覈結果、中國藥品生物製品檢定所出具的三批製品檢定報告等一併上報國家藥品監督管理局予以審批。