2 濃縮紅細胞的製備
可在全血有效保存期內的任何時間移出血漿,根據移出血漿量不同,紅細胞比容可爲 70%~90%,但以70%的紅細胞爲佳,便於輸注。
2.1 製備方法
2.1.1 離心法
(2)將血袋連同轉移袋一起,用塑料氣包或其他方法夾持血袋,使血袋上部在離心杯中鼓起,處於直立的位置。
(3)將平衡好的成對離心杯,準確地掛在離心機轉頭兩個對稱的位置上蓋好離心機內外蓋,5000g離心7min,溫度4℃±2℃,使紅細胞快速下沉。如離心機性能有限,不可能達到以上離心力時,可根據情況,相應延長離心時間。
(4)將血袋放在血漿擠壓器兩夾板之間,去掉血袋與分漿管之間的堵頭,讓血漿流入轉移袋內。
(5)熱合封口,並切斷連接血袋和轉移袋之間的分漿管,血袋中留下部分即爲濃縮紅細胞。
2.1.2 自然沉降法
將血袋垂直吊掛於4℃±2℃冰箱內,使紅細胞自然下沉1~3d,或將血袋呈70°~80°角立於冰箱,需用時,用一次性分漿器分出血漿,製得濃縮紅細胞。
2.2 保存
3 洗滌紅細胞的製備
一般用生理鹽水反覆洗滌3~6次。經洗滌的紅細胞,除白細胞和血小板減少外,血漿蛋白也極少,紅細胞中殘存的血漿蛋白含量約爲原總蛋白的1%以下。
3.1 製備方法
3.1.1 手工洗滌法
必須在無菌室的超淨臺上操作。目前國家尚未生產統一的一次性洗滌器,故洗滌方法也不盡相同,在此僅介紹中國醫學科學院輸血研究所採用多節洗滌器 (包括1個三通接頭和多個二通接頭與多條塑料管連接而成)的洗滌方法。
(2)以1160g離心8min溫度20℃。
(3)分出上層血漿至2號轉移袋,將白膜層和白膜層下1.0~1.5cm厚的紅細胞移至 1號轉移袋,血袋中留下濃縮紅細胞。
(4)將濃縮紅細胞袋與多節洗滌器三通接頭一端連接,1000ml或500ml袋,或 500ml瓶生理鹽水和1000ml空塑料袋分別與三通接頭兩端連接。
(5)鬆開鹽水袋塑料管上的止血鉗,向血袋內灌入生理鹽水250-300ml。
(6)取下血袋,熱合封閉管口,充分混勻後再以5000g離心6min,溫度4℃±2℃。
(7)將血袋再次連接到多節洗滌器第2個二通接頭一端,鬆開空袋塑料管上的止血鉗,將洗滌液及剩餘的白膜層儘量擠入塑料袋內。
(8)重複步驟(5)-(7),反覆洗滌紅細胞 3~6次,至最後1次擠出洗滌液及剩餘白膜後,再注入約等於紅細胞1/2的生理鹽水,配製約爲70%比容的紅細胞懸液。
3.1.2 機器洗滌法
3.2 保存
4 代漿紅細胞的製備
將全血離心並移除絕大部分(90%以上)血漿後,將代血漿(大多含羥乙基澱粉和葡萄糖)或晶體鹽保存液加入紅細胞內,代替移出的血漿,製成代漿紅細胞或晶體鹽紅細胞懸液。
4.1 製備方法
2.4℃±2℃條件下,以5000g離心 7min。
4.再將另一轉移袋內代血漿保存液加入紅細胞內,其用量約等於原血漿。
6.熱合封口並切斷分漿管,製成代漿紅細胞。
4.2 附
如用單袋採血,離心分出卜層血漿後,可通過連接管灌入代血漿保存液。製備的代漿紅細胞在 24h內輸注。
4.3 保存
保存期因代血漿保存液的種類而定,如代血漿大多數含有羥乙基澱粉和葡萄糖等,於4℃±2℃保存期爲14-21d。SAG(氯化鈉、腺嘌呤和葡萄糖)保存液和SAGS保存液(氯化鈉、腺嘌呤、葡萄糖和蔗糖),添加到濃縮紅細胞中,其有效保存期分別爲35d和 42~49d。
5 去白細胞的紅細胞製備
5.1 製備方法
從全血或壓積紅細胞內去除白細胞的方法較多,其去除效果各不相同,但任何一種方法都不可能把白細胞全部除去。一般認爲去除70%以上即可避免因白細胞凝集所致的發熱反應。
5.1.1 離心法
是一種簡單而較爲有效的製備方法。
(1) 正位離心法:①用三聯塑料袋採集全血。②以1160g離心8min,溫度控制在20℃。③分出上層血漿至2號轉移袋內。④擠出白膜層及靠近白膜層1.0-1.5cm厚的紅細胞至1號轉移袋內。⑤爲提高白細胞除去率,可再將2號轉移袋內的血漿返回血袋。⑥充分混勻後重復步驟②~④。⑦以原血漿配製成70%比容的去白細胞的紅細胞。
(2)倒置離心法:①用特製三聯塑料袋採集全血。②將血袋倒置(底部朝上)離心,離心速度、時間和溫度同正位離心法。③將血袋放在倒置擠壓器上,夾住2號轉移袋通路,並打開1號袋通路,使血袋下部少含白細胞的紅細胞流入1號轉移袋,當白膜層離血袋下口約剩4cm時,適當減慢血流速度,以免形成旋渦而影響白細胞除去效果。④當白膜層離血袋下口只有2cm時,夾住通向1號轉移袋通路,打開2號轉移袋通路,讓白膜流入2號轉移袋。此時可用手指推擠白膜,儘量使更多的白膜擠入2號轉移袋內,直至連接管呈現粉紅色時,夾住通向2號轉移袋的塑料管。⑤從擠壓板上取下血袋,將去除白細胞的紅細胞返回原血袋內。⑥充分混勻後重復步驟②-④,以提高白細胞去除率。⑦將血漿與紅細胞一起正位離心,從血袋分出部分血漿置於紅細胞袋內,配製成70%比容的去白細胞的紅細胞。
5.1.2 過濾法
使血液通過特製過濾器,利用吸附或阻擋白細胞等原理,將白細胞除去,而製得去白細胞的紅細胞。過濾法簡單、方便,效果又好,它將有效地代替其他方法。
(1)尼龍纖維過濾器:根據尼龍纖維在鈣離子存在下,能選擇性地吸附白細胞這一特性,使血液通過尼龍纖維過濾器,將白細胞吸附,而獲得去白細胞的紅細胞。方法爲:①用肝素抗凝採集全血1個單位,過濾前不要將此血冷卻。②取出事先放入溫箱加溫至37℃的濾器,再用37℃鹽水灌注。③將血袋和濾器連接,於1h內將血液進行過濾,即獲得紅細胞。
(2)棉花纖維過濾器:可用於保存期內任何抗凝血。據文獻報道,接近貯存末期的血液去除白細胞的效果更好。一般過濾後的血液可除去95%以上白細胞,並保留95%以上紅細胞。
(3)微聚物過濾器:全血以5000g離心 7min後,置入4℃±2℃冰箱保存,於輸血前將血液通過1個孔徑爲20-40μm的微聚物過濾器進行過濾。
5.1.3 沉降法
使用沉降劑,如大分子右旋糖酐(分子量爲15萬~20萬)或羥乙基澱粉 (分子量爲30萬-40萬)或羧甲基澱粉鈉,促使紅細胞快速下沉,而白細胞仍保留在血漿中,分出上層富含白細胞、血小板血漿,下層即爲去白細胞的紅細胞。所得紅細胞可用生理鹽水配製70%比容的紅細胞懸液。本法技術簡單,操作時間短,不需昂貴設備,效果好;缺點是沉降劑分子量大,抗原性強,易引起變態反應。若使用低分子或中分子右旋糖酐或羥乙基澱粉,則沉降效果差。
5.1.4 洗滌法
6 濃縮粒(白)細胞的製備
6.1 製備方法
臨牀上輸注白細胞主要指粒細胞,其製備方法主要利用離心、過濾、沉澱等原理。
1.血細胞分離機單採粒細胞效果較好 (製備方法見有關章節)。
2.沉降法單採粒細胞 (1)將全血採入內含大分子羥乙基澱粉及抗凝劑的二聯血袋中。 (2)血袋垂直吊掛,靜置15min。 (3)分出上層富含白細胞、血小板血漿至轉移袋。 (4)以1220g離心5min,使白細胞下沉而血小板仍保留在上層血漿中。 (5)將上層的富血小板血漿分至紅細胞袋內,回輸給獻血者,留下的即爲濃縮粒(白)細胞。
如上反覆循環4次,加工血液1600ml,同時並用皮質類固醇激素動員,可從1個獻血者獲得1×1010個以上的粒細胞,供患者1次輸注。此法特別適用於嬰兒,因只需要1袋濃縮粒細胞(400ml血液)即可提供足夠的量。
3.離心擠白膜法 (1)用三聯塑料血袋採集全血。 (2)以1160g離心8min,溫度20℃。(3)分出上層血漿至2號轉移袋,留下約 15~20ml血漿。(4)將剩餘血漿連同白膜層及靠近白膜層下1.5-2.0cm厚的紅細胞一起擠入1號轉移袋,即爲濃縮白(粒)細胞。總量爲35~45ml,可獲得全血中60%以上的粒(白)細胞,其總數約爲1×109個。
本法的缺點是:①粒(白)細胞製得率及總數偏低。②每次輸注多個獻血者粒(白)細胞,易產生白細胞凝集素及HLA抗體,影響治療效果或出現輸血不良反應。③本製品含有較多的淋巴細胞,可能導致移植物抗宿主病。
6.2 保存
一般採用室溫(22℃±2℃)、不搖盪的方法保存濃縮粒(白)細胞,時間不超過8h。因此,粒(白)細胞製備後應儘快輸注,以免影響療效。
7 富含血小板血漿的製備
血小板是3種血細胞中最小、最輕的一種,比重約爲1.032。由於血小板比白細胞容易從全血中分離出來,因此血小板的輸注開展較早。分離方法可以從1袋全血中提取,也可用血細胞分離機從單個獻血者採集較大量的血小板,供給臨牀輸注。
(2)於4~6h內使用離心(1220g 離心5min),溫度爲22℃±2℃,使紅細胞、白細胞基本下沉,而血小板因比重較輕,大部分仍保留在血漿中。
8 濃縮血小板的製備
8.1 製備方法
2.將富含血小板血漿離心(4650g離心 6min或2980g離心20min),溫度22℃±2℃,使血小板下沉。
3.分出上層少血小板血漿,留下20~30ml血漿於血小板中,即爲濃縮血小板,約可獲得全血中60%以上的血小板。
4.由於2次離心,製備的濃縮血小板中血小板聚集成團,必須先放在22℃±2℃環境下靜置1-2h,待其自然解聚後,輕輕搖動血袋,使其成均勻混懸液後方可輸注。
8.2 製備時注意點
1.採血順利,無凝塊。
2.從全血採出到製備全過程,包括離心溫度,均要求在22℃+2℃環境中進行。即使不立即製備,也不要將全血放入冰箱。
3.製備時動作一定要輕,避免較強的物理刺激,而造成血小板不可逆性聚集,影響輸注效果。
4.影響血小板得率的關鍵是第1次離心條件,包括離心速度和時間。各單位可根據所使用離心機的性能,選用最佳離心條件。
6.避免過多的白細胞、紅細胞,特別是白細胞的污染,因混入大量的紅、白細胞,可使血小板保存期間pH下降,更嚴重的是可使患者產生白細胞凝集素或HLA抗體,影響血小板治療效果,故對血小板製品中的白細胞污染量應嚴加控制。
7.肉眼觀察應無凝集現象。
8.3 保存
以22℃±2℃振盪保存爲佳。天津醫用高分子廠生產的塑料袋可保存3d,但需增加血漿量至50-70ml。一般塑料袋只能保存24h。適合血小板保存的pH爲6.0~7.4。
9 新鮮液體血漿的製備
新鮮液體血漿含有全部凝血因子,包括第V和第Ⅷ因子,適合於沒有條件冰凍保存血漿的醫療單位。
9.1 製備方法
11 普通液體血漿的製備
11.1 製備方法
2.全血在保存期間或過期5d內自然沉降或離心後分出上層血漿,即爲普通液體血漿。
11.2 保存
普通液體血漿於4℃±2℃冰箱暫時保存,但必須於24h內輸用。由於製備方法是非密閉性的,有可能發生細菌污染,故4℃±2℃冰箱保存,仍可能有嗜冷細菌生長。
13 冷沉澱的製備
冷沉澱主要含有第Ⅷ因子、纖維蛋白原(第1因子)以及纖維結合蛋白等成分。
13.1 製備方法
3.製備冷沉澱前將新鮮冰凍血漿置於 4℃±2℃冰箱(約14h)或冰水中融化。
4.待其基本融化,仍留有少量小冰塊時進行離心(5000g離心10min),溫度控制在 4℃±2℃,使冷沉澱下沉。
5.儘快分出上層少冷沉澱血漿,留下約 15-25ml血漿於冷沉澱中。
6.可繼續置於-30℃以下低溫冰箱保存備用,或以37℃水浴中輕輕搖動融化後立即供臨牀輸注。
7.臨牀輸用冷沉澱前,將多袋冷沉澱融化後,揉搓袋壁,使冷沉澱分散到15~25ml血漿中;在無菌條件下,用一次性注射器把每個袋的內容物混合到一個袋中,最後用20-30ml生理鹽水沖洗各袋;將此沖洗後的冷沉澱生理鹽水混懸液注入到最終混合的冷沉澱袋中,熱合封口,即可輸注。
13.2 注意事項
第Ⅷ因子是一種很容易喪失活性的凝血因子,爲了獲得高活性的第Ⅷ因子,以取得最大療效,在製備冷沉澱過程中應注意以下事項:
1.要求採血順利,200~400ml採血時血液應在3-6min內採完,無凝塊。
2.採用兩次離心分離血漿,除去新鮮血漿中殘留的細胞成分;因血漿冰凍時可使細胞破裂,釋放凝血活性物質,影響第Ⅷ因子穩定性。
3.新鮮血漿從開始冰凍起在1h內應變成固態,溫度可維持在-65℃以下,或風冷式冰箱和機械冰箱或乾冰浴中(95%乙醇和碎乾冰浴中,可在15min內完成冰凍)。血漿袋在浸泡液體之前應用塑料套包裝好,保持其袋管乾燥。
4.每400ml全血製備的冷沉澱,要求第Ⅷ因子含量在80U以上,纖維蛋白原含量在220mg以上。