3 百日咳菌苗原液製造及檢定要求
3.1 菌種
1.1 製造百日咳菌苗之菌種、檢定用的Ⅰ相診斷血清、百日咳分型血清及百日咳參考菌苗，由中國藥品生物製品檢定所分發或經同意。
1.2 菌種檢定
1.2.1 培養特性
於包-姜（Bordet-Gengou）氏或其他適宜的培養基上培育，各菌株應具有典型的形態及生化特性。
1.2.2 血清學特性
將35～37℃培育40～48小時的菌苔，混懸於生理鹽水或磷酸鹽緩衝生理鹽水內，使每ml含菌20億個，與Ⅰ相血清做定量凝集反應，凝集效價應達到血清原效價之半。同時與單價分型血清做定量凝集反應，其型別應與該菌種標定型別相同。
用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育40～48小時的菌苔混懸於磷酸鹽緩衝生理鹽水內，然後稀釋爲幾個不同濃度的菌液，分別用每一稀釋度的菌液注射於家兔或豚鼠的皮內0.1ml，經72小時觀察反應。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4億個菌以下的菌液部位出現出血性壞死者爲陽性反應，判爲合格。
1.2.4 毒力試驗
用體重16～18g之小白鼠至少3組，每組至少10只，在麻醉狀態下從鼻腔滴入經培育40～48小時，以磷酸鹽緩衝生理鹽水稀釋的菌液0.05ml觀察14天，記錄小白鼠生死情況，按Reed Muench法計算LD50，LD50菌數不超過1.2億判爲合格。
1.2.5 免疫力試驗
1.2.5.1 方法
1.2.5.2判定
試驗菌液每個接種劑量的免疫效價應不少於4.0IU。若試驗菌液的效價低於此要求時，可複試，其結果的幾何平均值（如用概率分析法時，應用加權幾何平均值）≥4.0IU，仍判爲合格。
1.3.2 凍幹菌種應保存在2～8℃。凍幹後抽樣按1.2項進行檢查，合格的菌種可使用2年，以後每年檢查1次，如仍合格可繼續使用1年。
3.2 製造
2.1 製造百日咳菌苗原液至少應選用2個菌株，製成的菌苗應含1、2、3型因子。
2.2 製造百日咳菌苗原液用活性炭半綜合培養基或其他適宜的培養基。如用液體培養基，不得含有已知引起人體毒性或變態反應的成分。
2.3.1 菌種
凍幹菌種啓開後接種於改良包-姜氏或活性炭半綜合培養基或其他適宜的培養基上。於35～37℃培育不超過72小時，以後各代不超過48小時，傳代菌種保存不得超過14天，凍幹菌種啓開後用於生產時不應超過10代。
2.3.2 培育
可用固體法或液體法培育。培育時間不得超過48小時，經檢查爲純菌後，用適當方法收集菌體，混懸於pH值爲7.0～7.4的磷酸鹽緩衝生理鹽水中。
2.3.3 殺菌
原液可用不超過0.1%（ml /ml）甲醛溶液殺菌，放37℃2～3天。亦可用其他適宜的殺菌劑和殺菌方法殺菌。
2.3.4純菌試驗
原液應逐瓶（罐）抽樣接種普通瓊脂斜面及普通血液瓊脂斜面（或活性炭半綜合培養基）各1管，放35～37℃培育2天，然後放24～26℃1天。有雜菌生長者應廢棄。
2.3.5 原液合併
固體法工藝生產經純菌試驗合格的原液應進行合併。不同菌株不同日期製造2的原液應分別合併。合併後，可加適量防腐劑，並保存於2～8℃。
2.4 原液檢定
2.4.1 濃度測定
每瓶原液應按中國細菌濁度標準與質量檢定部門會同測定濃度。稀釋菌苗時即按此濃度計算。
2.4.2 鏡檢
每瓶原液取樣稀釋至成品濃度，塗片染色鏡檢，應爲革蘭氏陰性球桿菌。至少觀察10個視野，應無雜菌。
2.4.3 凝集反應
每瓶原液按1.2.2項與Ⅰ相血清做定量凝集試驗，其凝集效價應達血清原效價之半，如僅達到或低於血清原效價1/4時，應作免疫力試驗，合格後方可使用；同時應用單價分型血清做定性凝集試驗，其所含型別應與製造原液的菌種型別相同。
2.4.4 無菌試驗
每瓶原液除按《生物製品無菌試驗規程》進行無菌試驗外，並做特異無菌試驗。如特異無菌試驗有百日咳菌生長，可複試一次，若仍有百日咳菌生長，原液應判爲不合格。
2.4.5 毒性試驗
2.4.5.1方法
2.4.5.2 判定
試驗組小白鼠注射後72小時的總體重不少於注射前總體重，第7天小白鼠增加的體重不少於對照組增加體重的60%，並不得有死亡，該批原液毒性試驗判爲合格。
4 百日咳菌苗原液免疫力試驗方法
4.1 免疫
1.1 動物
將動物隨機分爲三組，每組16只或20只（同性或雌雄性各半，爲保證攻擊後有16只或20只小白鼠，可適當多免疫幾隻小白鼠），同時飼養健康小白鼠55只，備做對照用。
1.2 免疫原稀釋
將百日咳原液用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩衝生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2，然後再稀釋7.5×、37.5×、187.5×，百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU，然後再稀釋成每ml含1.0IU（0.125ml）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。
將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠，每隻小白鼠各腹腔注射0.5ml。
4.2 攻擊菌及攻擊菌液的製備
2.1 菌種
小白鼠腦內攻擊用58030（18323）菌株。
2.2 培養基
可用包-姜氏培養基（含羊血20%～30%）或其他適宜的培養基。
2.3 培養溫度及時間
放35～37℃培育，第一代不超過72小時，攻擊時菌種的培育時間爲20～24小時。原代菌種放2～8℃可保存2周。
2.4攻擊菌液的製備
將培育20～24小時的菌苔經肉眼檢查爲純菌後，刮入生理鹽水或pH7.3±0.1緩衝生理鹽水，用滅菌脫脂棉過濾，測定濃度，然後用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白腖水或肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬，作爲試驗組的攻擊菌液，然後再連續稀釋，使每0.03ml分別含8000、800、80及8個菌，以上5個不同稀釋度的菌液，作爲對照組的攻擊菌液。
2.5 工作起止時間
自攻擊菌液製備（開始刮菌）至注射完最後1只小白鼠不得超過2.5小時。
2.6活菌計數
在攻擊前後，可將0.03ml含8個菌的攻擊菌液，接種於包一姜氏培養基或其他適宜的培養基平皿中，每個平皿0.2ml，每次不得少於2個平皿，其菌落形成單位約爲濁度測定的1/4。
4.3 攻擊
動物免疫後14天，每隻小白鼠腦內攻擊0.03ml菌液（含8萬個菌），用0.25ml注射器，4號針頭。在試驗組攻擊後再進行對照組毒力測定，對照組每稀釋度攻擊10只小白鼠。
4.4 記錄結果
動物攻擊後觀察14天。攻擊後第2天，將試驗組動物處理成每組16只或20只。以後逐日觀察動物並記錄死亡數，最初3天死亡的動物不作統計，至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動物按死亡計算。
4.5 結果計算
5.1 按Wilson-Worcester氏法計算參考菌苗及待檢菌苗的ED50±SD%，每個ED50標準差的範圍一般應爲64%～156%。
5.2 按Reed-Muench氏法計算對照組LD50，1個LD50的菌數應不高於800個菌。
5.3 計算均質性因子“α”。
5.4IU計算
待檢原液每ml應含IU=參考菌苗ED50/待檢原液ED50×參考菌苗每ml的IU數
4.6 效力評價
5 百日咳菌苗原液毒性試驗方法
1 選用體重14～16g健康小白鼠，每批原液不少於10只（同性或雌雄性各半）。
2 以滅菌生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩衝生理鹽水（含成品菌苗相同量的防腐劑），將百日咳原液稀釋至成品菌苗濃度的1/2。
3 每隻小白鼠腹腔注射稀釋的原液0.5ml。另取同數量同體重的小白鼠（同性或雌雄性各半），腹腔注射稀釋用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩衝生理鹽水0.5ml作爲對照。
4 注射後的小白鼠應逐日觀察，並於餵食後2小時進行稱重。
5 於注射前、注射後72小時及7天，分別稱試驗組及時對照組小白鼠的體重。
6 試驗組小白鼠注射後72小時的總體重不少於注射前的總體重；7天小白鼠平均增加的體重不少於對照組平均增加體重的60%，並不得有死亡，該批原液毒性試驗判爲合格。
7 試驗結果若達不到上述要求，可進行復試，仍達不到上述要求，原液可放置2～8℃保存3～4個月再進行復試，如仍達不到上述要求，該批原液的毒性判爲不合格。
6 參考資料
- ^ [1] ．"中國生物製品規程"．