3 A羣腦膜炎球菌多糖菌苗製造及檢定規程
3.1 菌種
1.1 菌種來源
製造用的菌種及檢定菌種用的各種診斷血清，由中國藥品生物製品檢定所分發或經同意。
1.2 菌種檢定
1.2.1 形態及培養特性
將待檢的菌種接種在含10%羊血普通瓊脂培養基上，腦膜炎球菌在25℃不生長。35～37℃二氧化碳的環境中培養16～20小時，塗片鏡檢應爲革蘭氏陰性雙球菌，亦可有單個陰性球菌。平皿分離培養顯現光滑、溼潤、灰白色的菌落、菌苔易取下，在生理鹽水中呈均勻混懸液。
接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、果糖及蔗糖，於35～37℃培養5～7日，發酵葡萄糖、麥芽糖，產酸不產氣。
1.2.3 血清學特性
將在35～37℃培養16～20小時的菌苔，混懸於0.5%（ml /ml）甲醛生理鹽水中，或56℃加熱30分鐘殺菌後，使每ml含菌10億～20億，與同羣血清做定量凝集反應，放置35～37℃過夜，次日再放置室溫2小時觀察結果，以肉眼可見清晰凝集現象之血清最高稀釋度（+）爲凝集反應效價，必須達到原血清效價之半。
1.3.1 菌種應凍幹保存。凍幹後抽樣按上述各項要求進行檢查，合格後可作爲種子批菌種用於生產。
1.3.2 種子批菌種可低溫保存或置2～8℃冰箱中，生產前應檢查菌種的全部特性，合格後方可用於生產。
3.2 製造
2.1 菌種
將生產用種子批菌種啓開後，接種在10%羊血瓊脂或其他適宜培養基上，放35～37℃二氧化碳環境培養一般不超過18小時，第2～4代菌種可用適宜的固體或液體培養基，35～37℃固體培養基培養不超過18小時，液體培養基培養不超過12小時。菌種自啓開後最多不能超過5代。
2.2 培養基
生產多糖菌苗可選用適宜培養基。生產用的液體培養基不應含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉澱的成分。培養基中不應含有對人體有害或其他過敏物質。
2.3 培養
採用培養罐液體培養，在培養過程中及殺菌前取樣進行純菌試驗，塗片做革蘭氏染色鏡檢，如發現污染雜菌，應廢棄。培養物於對數生長期後或靜止期前期收穫。一般培養6～8小時（隨菌種接種量及使用培養基種類的不同而異）爲宜。
2.4 殺菌
培養物加入甲醛溶液殺菌，或加熱56℃10分鐘，以確保殺菌完全及不損傷流腦多糖爲宜。
2.5 去核酸
殺菌完成後，離心去菌體收集上清液，於其中加入十六烷基三甲溴化銨，充分混勻形成沉澱。放置適當時間離心，收集沉澱物。沉澱物中加入氯化鈣溶液，使其最終濃度爲1mol/L，搖動或攪拌1小時，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度爲25%（ml/ml）。冷庫靜置1～3小時或過夜，離心去沉澱，收集澄清的上清液。
2.6 沉澱多糖
於上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度爲80%（ml /ml），充分振搖。使多糖沉澱，離心收集沉澱多糖，然後用無水乙醇及兩酮各洗二次以上，將沉澱物（多糖粗製品）保存在-20℃以下待進一步提取。
2.7 多糖的精製
將粗製品溶解於1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達10～20mg/ml，然後按1∶2容量用冷酚（100g結晶酚溶於40ml1∶10飽和醋酸鈉溶液）提取2～3次，提取時充分振搖。然後離心收集上清液，並用0.1mol/L氯化鈣溶液或適宜的溶液透析。必要或有條件時也可用其他方法去除內毒素活性。再加乙醇至最終濃度爲75%～80%（ml /ml）。離心收集沉澱物用無水乙醇及丙酮各洗二次以上。離心後傾去上清液，用無熱原蒸餾水溶解沉澱的多糖，所得溶液即爲提取之多糖，經除菌過濾後，取樣進行無菌試驗、血清學試驗及各項生化測定。提取過程應儘量在15℃以下進行。提純多糖應保存在-20℃或以下。
3.3 半成品檢定
3.1 化學測定
按《生物製品化學檢定規程》進行。每批多糖應測定固體總量，計算乾重。
3.1.1 蛋白質含量
每批提純多糖抗原的蛋白質含量（按重量）應小於10mg/g。按Lowry法，用牛血清白蛋白作對照。
3.1.2 核酸含量
每批提純多糖的核酸含量（按重量）應小於10mg/g。按分光光度法，核酸在260nm處的吸收係數（E1%1cm）爲200。
3.1.3 O-乙酰基含量測定
每批提純多糖的O-乙酰基含量應≥2mmol/g。按Hestrin法測定。
3.1.4 磷含量
每批提純多糖的磷含量應≥80mg/g。用鉬酸胺法測定。
每批提純多糖的分子大小應用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過濾法測定。Kd值應≤0.40。kd值在0.5以前的洗脫液多糖回收應在65%以上。
每批提純多糖應用血凝抑制試驗（或其他適宜方法）進行血清學特異性試驗。A羣半成品多糖抗原在抗A羣腦膜炎球菌抗體存在下，應特異抑制A羣腦膜炎抗原致敏的紅血球凝集。
3.4 提純多糖的蛋白、核酸及脂多糖含量若達不到要求可進行再處理。
3.4 提純多糖稀釋
可用單批或多批多糖合併，然後加入無菌乳糖和無菌蒸餾水（無熱原）稀釋，使每人份菌苗含多糖30μg，乳糖2.5～3.0mg。乳糖規格應爲分析純結晶體。
3.5 分裝與乾燥
分裝及容器的要求同《生物製品分裝規程》。
3.6 成品檢定
6.1 鑑別試驗
6.2 多糖濃度
每批菌苗應檢查多糖含量，每人份多糖應不少於30μg。磷含量應在2.25μg以上。
6.3 無菌試驗
每批菌苗應按《生物製品無菌試驗規程》進行。
6.4 安全試驗
6.4.1 熱原質試驗
每批菌苗應按《生物製品熱原質試驗規程》進行，家兔注射劑量爲0.025μg/kg。判定標準按該規程4.2項要求進行。
6.4.2 毒性試驗
6.4.2.1 豚鼠毒性試驗
至少用5只體重350～400g的豚鼠，每隻腹腔注射500μg多糖（1ml），觀察7天，不應引起明顯症狀或死亡。
6.4.2.2 小白鼠毒性試驗
至少用5只體重18～20g的小白鼠，每隻腹腔注射100μg多糖（0.5ml），觀察7天，不應引起明顯症狀或死亡。
分裝的菌苗至少5批抽一批測多糖分子大小，用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過濾法測定，kd值應≤0.40。kd值在0.5以前的洗脫液多糖回收率應在65%以上。
6.6 水分測定
3.7 菌苗稀釋液檢定
7.1 無菌試驗
每批稀釋液應按《生物製品無菌試驗規程》進行。
7.2 安全試驗
每批稀釋液用體重18～20g小白鼠5只，每隻腹腔注射0.5ml，觀察7天，應健存。
7.3 熱原質試驗
按《生物製品熱原質試驗規程》進行。
3.8 保存與效期
4 A羣腦膜炎球菌多糖菌苗使用說明書
本品系用A羣腦膜炎球菌經提純製成的多糖菌苗，供預防A羣腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎之用。
本品爲白色疏鬆體，加所附緩衝生理鹽水後迅速溶解，溶液澄明無異物。
4.1 接種對象
6個月～15週歲兒童。初免年齡從6月齡開始，3歲以下接種2針，間隔3個月。3歲以上接種一針，接種應於流腦流行季節前完成。根據需要每3年複種一次。在遇有流行的情況下，可擴大年齡組作應急接種。
4.2 用法
1.使用前檢查安瓿，不應有裂紋，安瓿內不應有異物。
4.3 禁忌
有下列情況者不得使用本菌苗。
4.4 反應
反應輕微，偶有短暫低熱，局部稍有壓痛感。
4.5 保存
應保存於2～8℃。
5 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》"．