3 藥典標準
3.1 藥品名稱
3.2 拼音名
Liuxingxing Yixingnaoyan Miehuo Yimiao
3.3 英文名
INACTIVATED JAPANESE ENCEPHALITIS VACCINE
3.4 來源(分子式)與標準
本品系用流行性乙型腦炎病毒毒種，經在地鼠腎單層細胞培養後，收取病毒液，用 甲醛溶液滅活製成。
3.5 性狀
3.6 檢查
照《中國生物製品規程》中流行性乙型腦炎滅活疫苗製造及檢定規程的 各項規定進行試驗，均應符合規定。
3.7 類別
生物製品。
3.8 劑量
臨用前加入亞硫酸氫鈉溶液適量中和甲醛，在上臂外側三角肌附着處皮 下注射，用量照介紹的規定。
3.9 貯藏
在2 ～8 ℃的暗處保存。
4 流行性乙型腦炎滅活疫苗製造及檢定規程
[1]流行性乙型腦炎（下稱乙腦）滅活疫苗是將乙腦病毒接種於地鼠腎細胞，培育後收穫病毒液，加入甲醛溶液將病毒殺死後製成。用於預防乙腦。
4.1 毒種
1.1 毒種來源
P3株病毒，每3～5年應用新分離的乙腦流行株病毒檢查P3株的保護力，以瞭解該毒株的有效性。P3株乾燥毒種由中國藥品生物製品檢定所分發。
1.2 毒種檢定
1.2.1 無菌試驗
每正代必須用體重7～9g小白鼠進行腦內滴定，滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用於生產。
1.2.3 純毒試驗
生產前和生產末期用小白鼠做腦內法中和試驗，以鑑定毒種的特異性。所用特異性抗血清由中國藥品生物製品檢定所提供。中和指數必須在500以上。生產過程中如對毒種發生疑問，應及時進行鑑定。
1.3毒種傳代
分正亞代傳遞。從檢定所取回的乾燥毒種傳遞不超過15代稱正代，由正代傳遞一代直接用於生產稱亞代。每次用於傳代的毒種不得少於3個鼠腦。
傳代時選用體重7～9g健康小白鼠或乳鼠，腦內接種病毒，72小時後選眼結膜正常，有典型痙攣戰粟、肢體麻痹的小白鼠，無菌取腦並進行無菌試驗。
1.4 毒種保存
鼠腦毒種收剖經無菌試驗後立即保存於-60℃以下，無菌試驗通過後方可使用。亦可將鼠腦毒種研磨乳化製成10%腦懸液，分裝小瓶凍存於-60℃以下，無菌試驗合格後備用。
4.2 疫苗製造
2.1 細胞製備
2.1.1 地鼠
取腎剪碎，用適量的胰蛋白酶溶液消化。用營養液分散細胞，製備細胞懸液，分裝培養瓶，於37℃進行培養。營養液中牛血清含量不得超過8%。
每生產批細胞留5%（或不少於500ml）懸液作爲對照細胞檢查外源病毒。該細胞除不接種病毒外，細胞濃度和處理均與生產過程平行進行，至原液收穫之日用顯微鏡觀察，應無病變發生。並用0.2%～0.5%豚鼠紅細胞（4℃保存不超過7天）進行血吸附試驗，置4～8℃30分鐘判定結果，再置20～25℃30分鐘再次判定結果，均應爲陰性。如有可疑病變或血吸附可疑陽性，在同種細胞上繼續盲傳，如傳出病毒，該批細胞製備的疫苗應予廢棄。
2.2 病毒接種和培育
挑選生長良好的細胞瓶，充分淋洗細胞後加入適量維持液，接種病毒，病毒量不得＞7.0LogLD50/1.0ml。在適當溫度下培育適當時間，棄去病毒培養液，換以新維持液，繼續培育一定時間。
2.3 原液
2.3.1 過濾
選擇有典型細胞病變的培養瓶，經肉眼檢查無菌者進行澄清過濾，細胞質量好時，可再加入新維持液，繼續培育，再次收穫病毒液。
過濾後的原液，於取出無菌試驗和病毒滴定樣品後加入甲醛溶液，其最終濃度不得超過0.05%，置適當溫度下一定時間滅活病毒。過濾後加入硫柳汞防腐劑，其最終濃度不得超過0.01%。
2.3.3 原液檢定
2.3.3.1 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
每個滴定批代表疫苗不得超過15萬ml，將樣品10倍系列稀釋，取至少3個稀釋度，每個稀釋度用體重7～9g小白鼠4只，每隻腦內接種0.03ml，逐日觀察，3日內死亡者不計，觀察14天，滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判爲合格，不合格者可重試一次。
2.4 半成品
無菌試驗合格及病毒滅活到期的疫苗原液，取樣做滅活試驗、效力試驗和無菌試驗。每次解剖的地鼠製備的疫苗爲一生產批，按生產批進行檢定，但每批滅活試驗代表疫苗量不得超過15萬ml，每批效力試驗代表疫苗量不得超過100萬ml。無菌試驗按《生物製品無菌試驗規程》進行。
2.4.2 半成品檢定
2.4.2.1 滅活試驗
（1）動物法：將樣品腦內接種體重12～14g小白鼠8只，每隻 0.03ml，同時腹腔接種0.5ml，爲第一代；7天后將第一代小白鼠處死3只，取腦做成10%懸液，腦內接種6只小白鼠，爲第二代；7天后將第二代小白鼠處死3只，同法接種6只小白鼠，爲第三代。從接種之日起逐日觀察14天，每代小白鼠除處死和接種後3日內非特異性死亡者外，全部健存爲合格。
若傳代3日後有個別小白鼠死亡，應立即取死鼠腦乳化成懸液再接種3只小白鼠，觀察14天，該3只小白鼠健存仍判爲合格。如仍有小白鼠死亡，該批疫苗應重試，重試合格後仍可使用。若傳出活病毒應重試，查明原因。必要時繼續滅活並進行滅活試驗，若仍傳出活病毒，該批半成品應予廢棄。
（2）細胞培養-動物法：將樣品25ml透析24小時後，接種地鼠腎細胞或BHK21細胞，每ml樣品接種不少於3cm2細胞片，置培養病毒的溫度下培育14天，不得有細胞病變出現。到期的培養液腦內接種體重7～9g小白鼠10只，每隻0.03ml，觀察14天，應全部健存。若有死亡者應查明原因或重試，重試合格者仍可使用。不合格者應廢棄。
2.4.2.2 效力試驗
採用免疫小白鼠中和抗體測定法。中和抗體測定採用蝕斑減少試驗。參考疫苗（RA和RB）及中和試驗陽性血清由中國藥品生物製品檢定所提供。
將被檢苗（T）和參考苗（R）稀釋成1∶32腹腔免疫體重12～14g小白鼠10只，每隻0.5ml，免疫2次，間隔7天，第二次免疫後7天採血，分離血清，同組小白鼠血清等量混合，56℃30分鐘滅活，備用。
稀釋陽性血清、被檢苗血清和參考苗血清，分別與稀釋好的病毒（約200PFU/0.4ml）等量混合，同時將稀釋好的病毒再1∶2稀釋，作爲病毒對照，置37℃水浴作用90分鐘，接種6孔板BHK21細胞，每孔0.4ml，37℃孵育90分鐘，加入含甲基纖維素的培養基覆蓋物，於CO2孵箱中培育5天，染色，蝕斑計數，計算被檢苗和參考苗組對病毒對照組的蝕斑減少率。病毒對照組的蝕斑平均數應在50～150之間。
判定標準
（1）合格：T≥（RA+RB）/2-0.33
（2）重試：（RA+RB）/2-0.66＜T＜（RA+RB）/2-0.33
（3）不合格：T＜（RA+RB）/2-0.66
用檢定所認可的試劑和方法測定，殘餘牛血清蛋白含量應≤50ng/ml。
4.3 成品檢定
3.1 外觀檢查
3.2 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
3.3 化學檢查
按《生物製品化學檢定規程》進行。pH值爲7.2～8.0。遊離甲醛不高於0.05%，硫柳汞不高於0.01%。
3.4 安全試驗
每批疫苗腹腔注射體重18～20g小白鼠4只，每隻0.5ml，逐日觀察3天，均應健存，如有小白鼠死亡，除檢查原因外，應立即進行重試。
3.5 亞硫酸氫鈉檢定
分裝後的亞硫酸氫鈉要進行含量測定和無毒性試驗。含量不得低於原配濃度的60%。無毒性試驗系將樣品稀釋成1∶100，腹腔注射體重18～20g小白鼠2只，每隻0.5ml，觀察5日，應全部健存。
4.4 保存與效期
5 流行性乙型腦炎滅活疫苗使用說明書
本品系將流行性乙型腦炎病毒接種地鼠腎細胞，培養後收穫病毒液，另入甲醛溶液將病毒滅活後製成，爲橘紅色透明液體，含硫柳汞防腐劑，用於預防流行性乙型腦炎。
5.1 接種對象
5.2 用法
1.於上臂外側三角肌附着處皮膚消毒後皮下注射。
2.劑量如下：
| 年齡組（初免） | 第1針 | 第2針 | 加強針（初免後1年） |
| 6個月～7週歲 | 0.5ml | 0.5ml | 0.5ml |
| 7週歲以上 | 1.0ml | 1.0ml | 1.0ml |
注：第1針與第2針間隔7～10日。爲減少注射疼痛，在疫苗中可加入適量亞硫酸氫鈉液，疫苗由紅色變爲黃色，即可注射。
5.3 禁忌
發熱、急性疾病及嚴重慢性疾病、神經系統疾病、過敏性疾病和既往對抗生素、生物製品有過敏史者均不可注射。
5.4 反應
注射後一般無反應。個別有發熱、頭暈或皮疹者應注意觀察，必要時給予適當治療。
5.5 注意事項
1.疫苗混濁、變色、曾經凍結，安瓿有裂紋、有異物者均不可使用。
2.應備有1∶1000腎上腺素，以備偶爾發生休克時急救用。接受注射者在注射後應在現場休息片刻。
5.6 保存
應保存於2～8℃暗處。
6 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》"．