3 凍幹人凝血因子Ⅷ濃製劑製造及檢定規程
[1]本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鮮血漿分離、提純、凍幹並經病毒滅活製成。主要成份爲人凝血因子Ⅷ及少量纖維蛋白原，含適量枸櫞酸鈉，不含防腐劑。本品對缺秒人凝血因子Ⅷ所致的凝血機能缺陷具有糾正作用，專供防治甲型血友病患者的出血症狀。
3.1 製造
1.1製造要求
1.1.1 對血漿的要求
1.1.1.1所用之血漿來源應符合《原料血漿採集（單採血漿術）規程》要求，血漿應無凝塊、無纖維蛋白析出，非脂血，無溶血。在採集時應減少皮膚損傷，保持血流通暢，並與抗凝劑充分混合，用塑料袋採集。新鮮分離液體血漿或新鮮冰凍血漿及凍結冷沉澱，均可用於生產。
1.1.1.2分離後的血漿應保持無菌，並應及時冰凍保存。自採血到凍結一般在8小時內完成。液體血漿應在4±2℃貯放，貯放時間應不超過小時，最長不得超過12小時。冰凍血漿（-30℃以下）保存期不超過6個月。
1.1.2 對製造工作室、設備及原材料的要求，與《人血白蛋白（低溫乙醇法）製造及檢定規程》中1.1.3～1.1.4項要求相同。
1.2 製造工藝
1.2.1 採用低溫乙醇法或凍融法制得冷沉澱，經抽提、吸附、精製，亦可採用經衛生部批准的其他工藝製備，並經衛生部批准的適宜方法進行病毒滅活處理。
1.2.2 分批
同一製造工藝、同一容器混合的製品作爲一批，不同濾器和不同機櫃凍乾的製品分爲亞批。
1.2.4除菌過濾及分裝
本品應用微孔薄膜過濾，可直接分裝無菌的成品瓶內，每瓶裝量根據效價及規格確定。
1.2.5 半成品檢定
1.2.6 凍幹
除菌過濾分裝的製品經外觀檢查後立即凍結，並按《人血白蛋白（低溫乙醇法）製造及檢定規程》1。2。5項規定進行凍幹，但製品溫度不得超過35℃。
1.3 規格
每瓶含人凝血因子Ⅷ的效價可有50、100、200、300、400IU五種，製品的效價應標示在瓶籤及包裝上。
3.2 成品檢定
2.1抽樣
每批製品應抽樣作全面質量檢定，不同機櫃凍乾的製品分別抽樣做無菌試驗和水分測定。
2.2 物理檢查
2.2.1 外觀
應爲乳白色疏鬆體，無融化跡象。溶解後溶液澄清或輕微乳光，允許有微量細小蛋白顆粒。
2.2.2 真空度
以高頻火花真空測定器檢測，瓶內應出現藍紫色輝光。
2.2.3 溶解時間
從冰箱取出的製品應先平衡至25～37℃，然後按瓶籤標示量加入適量30～37℃滅菌注射用水，使其每ml含4IU。製品應於30分鐘內溶解。
2.3 化學檢定
按《生物製品化學檢定規程》進行。
2.3.1 水分
水分含量應≤3%（g/g）。
2.3.2pH值
取2.2.3項下溶解在20±2℃測定，pH值應爲6.8～7.6。
2.3.3 鈉離子測定
取2.2.3 項下溶液測定，鈉離子含量應≤160mmol/L。
取2.2.3項下溶液測定，如加枸櫞酸鈉作穩定劑，其枸櫞酸離子含量應≤25mmol/L。
2.4 效價測定
取2.2.3項下溶液用一步或二步法（見附錄）進行測定，每瓶所含人凝血因子Ⅷ的效價應不低於標示量的80%。
2.5 比活性
2.6HBsAg檢測
2.7 抗HCV檢測
2.9 無菌試驗
樣品溶解後按《生物製品無菌試驗規程》進行。
2.10 安全試驗
2.10.1 豚鼠試驗
用體重300～400g健康豚鼠2只，每隻腹腔注射檢品15IU，注射後半小時內動物不應有明顯的異常反應，觀察7天，動物均健存，每隻體重增加者判爲合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠複試一次，判定標準同前。
2.10.2 小白鼠試驗
用體重18～20g小白鼠5只，每隻腹腔注射檢品1.5IU，半小時內動物不應有明顯的異常反應，繼續觀察7天，動物均健存，每隻體重增加者判爲合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠複試一次，判定標準同前。
2.11 熱原質試驗
按《生物製品熱原質試驗規程》進行，注射劑量按家兔體重注射10IU/kg。判定標準按該4.2項要求進行。
2.12 鑑別試驗
用免疫雙擴散法，僅與抗人的血清產生沉澱線，與抗馬、抗牛血清不產生沉澱線。
3.3 保存與效期
4 人凝血因子Ⅷ效價測定（一步法）
4.1 試劑
1.1樣品稀釋液：取1容積的3.8%枸櫞酸鈉液加入5容積咪唑緩衝液。
1.1.1 咪唑緩衝液
稱0.68g咪唑和1.17g氯化鈉溶於100ml蒸餾水中，加入42.2ml 0.1mol/L鹽酸，然後被 加入蒸餾水至200ml,pH爲7.3。
1.2 血小板代用品“兔（人）腦組織的氯仿抽提液”。用前用生理鹽水稀釋至適當倍數。
取人凝血因子Ⅷ含量低於2%的血友病病人血漿或人工基質血漿，然後分裝於5ml安瓿，凍幹或-30℃保存。
稱111g氯化鈣溶於1000ml蒸餾水中，配製成1mol/L氯化鈣貯存液，用前進行20倍稀釋，配成0.05mol/L氯化鈣溶液。
人凝血因子Ⅷ國家標準品或經國家標準品標化的工作標準（定量分裝凍幹，置-30℃保存，一般2IU/ml左右），用前取樣品稀釋液溶解成1IU/ml。
標準血漿系取30份新鮮正常人血漿等量混合後，分裝於小瓶內，置-30℃保存。自採血後至分漿凍結整個過程不得超過4小時。
1.7待測樣品
4.2 測定
2.1取2支試管，每管加入0.1ml基質血漿和0.1ml樣品稀釋液，混勻，再加0.1ml血小板代用品和0.1ml白陶土懸液，混勻，將試管置37℃水浴保溫一定時間（一般2～6分鐘），然後加入0.1ml0.05mol/L氯化鈣溶液，記錄凝固時間，2管平均值爲基質血漿的“空白”值（一般應大於3分鐘）。
用樣品稀釋液分別進行10倍、20倍、40倍、100倍和200倍稀釋，用不同稀釋濃度標準品代替2.1項試驗中樣品稀釋液，按上述方法分別測定凝固時間。
2.3 待測樣品稀釋成約0.02～0.04IU/ml，代替2.1項試驗中樣品稀釋液，同時分別測定凝固時間。
2.4測定時要求每個稀釋度平行測定2管，兩管之差不得超過均值10%，否則重測。
4.3 計算
將標準品5個不同稀釋度所含人凝血因子Ⅷ單位（IU/ml），分別取其對數值，再將其各相應濃度所測得凝固時間（秒），也分別取對數值，然後按照統計學方法作直線迴歸方程。
方程式：log y=b olg x+a
其中x代表人凝血固子Ⅷ單位數，y代表測得相應凝固時間（秒）。
5 人凝血因子Ⅷ效價測定（二步法）
5.1 材料
1.1試劑
1.1.10.05mol/L CaCl2溶液
稱7.35gCaCl2·2H2O（分析純），加蒸餾水溶解，稀釋至1000ml。
1.1.20.025mol/L CaCl2溶液
稱3.675gCaCl2·2H2O（分析純），加蒸餾水溶解，稀釋至1000ml。
1.1.3 咪唑緩衝液
稱0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶於約100ml蒸餾水中，加37.2ml0.1mol/l HCl，加蒸餾水至200ml，pH爲7.3～7.4。
1份3.8%枸櫞酸三鈉溶液加5份0.85%NaCl溶液混勻。
1.1.5Al(OH)3膠
a稱（NH4）2SO45.5g，溶於150ml63℃蒸餾水中。
B稱氨明礬19.175g，溶於250ml58℃的蒸餾水中。
C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸餾水。
三種溶液配畢後，立即將c液迅速倒入a液中攪勻，然後在攪拌下將此混合液迅速倒入b液，用力攪拌10分鐘（保持溫度不低於58℃），離心（2500r/min，15分鐘），棄上清，沉澱洗滌5次。
第一次：用75ml蒸餾水加0.055ml氨水（比重0.88）混勻，離心，棄上清。
第二次：用75ml蒸餾水加0.11ml氨水（比重0.88）混勻，離心，棄上清。
第三、四、五次分別用75ml蒸餾水洗。
將沉澱物懸浮於總體積爲175ml蒸餾水中，混勻，分裝，4℃保存。
1.1.6 正常人血清
分別收集20份以上正常人血於乾燥滅菌的玻璃瓶中，待血凝固後，放於37℃保溫5～6小時，置4℃冰箱過液，分離血清，混勻，定量分裝（0.5ml/安瓿），冷凍乾燥，-20℃保存。
用時，取凍幹品1支，按標示量加蒸餾水溶解，然後用咪唑緩衝液作1∶10稀釋，4℃冰箱過夜（使血清活化），試驗當日再用咪唑緩衝液作最適濃度稀釋（一般爲1∶20），置冰浴備用。
1.1.7 牛Ⅴ因子
收集公牛血於乾燥滅菌的玻璃容器中，室溫放置4小時，離心（2500r/min，30分鐘），分離血清，取血清加10%（g/ml）BaSO4在室溫下攪拌吸附40分鐘，離心（2500r/min，40分鐘），棄沉澱，定量（1ml/瓶）分裝，冷凍乾燥，-20℃保存。
用時取凍幹品1支，按標示量加蒸餾水溶解，用生理鹽水作最適濃度稀釋（一般爲1∶20），置冰浴備用。
1.1.8 磷脂
取新鮮腦（人，牛，兔），除去表面血管、腦膜，儘可能除去白質，切成薄片，稱重，輕輕搗碎，用3倍腦組織的丙酮提取5次，每次用雙層綢布濾幹，最後腦粉於37℃乾燥1小時，稱取腦粉1g，加20ml氯仿提取，於室溫振搖2小時後，用單層濾紙過濾，濾液放抽氣櫃內用吹內機吹至微幹，加10ml生理鹽水研製成白色均勻乳狀液，定量（0.1ml/瓶）分裝，冷凍乾燥，-20℃保存。
用時，取凍幹品1支，按標示量加蒸餾水溶解後，用鹽水作最適濃度稀釋（一般爲1∶100～1∶500），置冰浴備用。
5.2 操作
2.1試劑混合
2.2.1 若試驗血漿對標準血裝（標準血漿爲未吸附者）：二者按1ml血漿加0.1ml Al(OH)3懸浮液混合，置37℃水浴吸附3分鐘，離心取上清備用。
2.2.2 試驗血漿對濃縮標準或試驗濃製品對標準血漿：用Ⅷ因子嚴重缺乏的血漿（Ⅷ因子含量＜1%）稀釋濃縮標準品或試驗濃製品使成0.5～1.0IU/ml，然後按2.2.1法進行吸附處理。
2.2.3濃縮試驗品對濃縮標準品：直接溶解稀釋成0.5～1.0IU/ml。
2.2.4標準品和檢品準備好後，立即用枸櫞酸鹽一氯化鈉溶液分別作3個連續倍倍稀釋，使最低和最高稀釋度的凝結時間在17～35秒間（一般爲1∶16～1∶256）
2.3 測定
2.3.1 第一步，混合物的保溫
取7支玻璃凝集管放入冰浴中，每管加0.3ml混合試劑，然後於第1、2、3管分別加高、中、低稀釋度的標準品各0.1ml，第4、5、6管分別加高、中、低稀釋度的樣品各0.1ml，第7管加枸櫞酸鹽-氯化鈉溶液0.1ml（作空白）；從第1管開始逐管移入37℃水浴，加0.05mol /L預溫CaCl2溶液0.1ml，混勻，記時。每管移入37℃水浴及加CaCl2溶液的時間間隔均爲1分鐘。
2.3.2 第二步，凝血酶原激活物生成量的測定（取樣時間以15分鐘和21分鐘爲例）
另取13支凝集管，每管各加入0.025mol/l CaCl2溶液0.2ml，當第一步第1管保溫至12分鐘時，將此13支凝集管和1支裝有基質血漿的試管放入37℃水浴中，待混合物保溫至14分鐘40秒時，從第1保溫管中取出0.1ml混合物加到1支含有0.025mol/l CaCl2溶液的凝集管中，於15分鐘時，加入0.2ml基質血漿混勻，另用一隻秒錶記錄從基質血漿加入到纖維蛋白形成所需的時間（纖維蛋白形成可用肉眼觀察，也可用儀器測量），其餘各管每隔1分鐘如此依次進行，並於第21～26分鐘作第二系列測定，兩系列所測得凝結時間不應相差5%（說明穩定的凝血酶原激活物已形成，否則保溫時間應調整）。空白管於第27分鐘時取樣測定。
爲了消除試驗順序誤差，將標準品和樣品的試驗順序改變，2.3.1及2.3.2項過程重複一次。
2.4 計算
2.4.1 作圖法
用雙對數紙，以凝結時間（秒）爲縱座標，稀釋度（如25%、50%、100%……）爲橫座標，分別將標準品和樣品兩套試驗結果的平均凝結時間作兩條平行線，從100%含量的稀釋度處作一垂直線與試驗線相交，通過交點作一水平線與標準線相交，再通過交點作一垂直線與橫座標相交，其交點讀數即爲試驗樣品相當於標準品的百分含量。若標準線和試驗線的直線性、平行關係有顯著性差異，或空白試驗小於40秒，則分析結果無效。
2.4.2 用3.3平行線法公式計算
樣品效價（IU/ml）=log-1（I·V/W）標準品效價·樣品稀釋倍數×D值
I=0.301(2倍系列稀釋法的常數)
V=1/3（T1+T2+T3－S1―S2―S3）
T1、T2、T3爲樣品3個倍倍稀釋度的凝固時間（秒）
S1、S2、S3爲標準品3個倍倍稀釋度的凝固時間（秒）
若V爲負值，變爲正值後再代入上面公式計算，若V爲正值，變成負值後再代入上面公式計算。
W=1/4（T3－T1＋S3－T1）
5.3 注意事項
3.1因Ⅷ因子易變不穩定，因此在進行標準品和樣品的稀釋時，應快而準確，稀釋後立即檢定，冰浴中不得放置30分鐘以上。
3.2試驗中各試劑的最適稀釋度和混合物保溫時間隨試劑的變化而異，故應作試驗預測，稀釋試劑應在冰浴中放置，使用時間超過半天應重新配製。
6 凍幹人凝血因子Ⅷ濃製劑使用說明書
本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鮮血漿分離、提純、經病毒滅活、凍乾製成。主要成份爲人凝血因子Ⅷ及少量纖維蛋白原，含適量穩定劑，不含防腐劑，爲乳白色疏鬆體。本品對缺少凝血因子Ⅷ所致的凝血機能缺陷具有糾正作用，專供防治甲型血友病患者的出血症狀。
6.1 用法
本品專供靜脈輸注，應在臨牀醫師的嚴格監督下使用。用前應先以30～37℃滅菌注射用水或5%葡萄糖注射液按瓶籤的標示量注入瓶內（製品剛從冰箱取出或在冬季溫度較低時應特別注意使製品溫度升高到26～37℃，然後進行溶解，否則易析出沉澱），輕輕搖動，使製品全部溶解（注意勿使產生泡沫），然後用帶有濾網的輸血器進行靜脈滴注，滴注速度一般以每分鐘60滴左右爲宜，製品溶解後應立即使用。並在1小時內輸完，不得放置。
使用劑量由醫師視病人的症狀而定，本品有50、100、200、300及400IU等不同規格，以供不同情況下使用。每kg體重輸入1IU因子Ⅷ，可使循環血液中因子Ⅷ水平提高2.5%左右，一般在輕度出血時需將病人血液中因子Ⅷ含量提高到正常人水平的15%左右，並維持24～72小時。中度出血或小手術時需提高到20%～30%水平，維持48～96小時。大出血或進行較大手術時，則需提高到30%～50%或更高水平，維持4～14天以上。後期的維持量可適當減少，治療至傷口癒合。根據因子Ⅷ的生物半衰期，在臨牀使用時一般間隔8～12小時補充輸注一次，以保證循環血液中的因子Ⅷ達止血水平。
6.2 注意事項
1.在大量反覆輸入本品時，應注意出現過敏反應，溶血反應及肺水腫的可能性，對有心臟病的患者尤應注意。
2.本品溶解後一般爲澄清略帶乳光的溶液，允許微量細小蛋白顆粒存在，爲此用於輸注的輸血器必須帶有濾網裝置，但如發現有大塊不溶物時，則不可使用。
3.本品對於因缺乏因子Ⅸ（血漿凝血活酶成分，即PTC）所致的乙型血友病，或因缺乏因子Ⅸ（血漿凝血活酶前質，即PTA）所致的丙型血友病沒有療效，故在用前應確診患者系屬因子Ⅷ缺乏，方能對症下藥。
4.本品不得用於靜脈外的注射途徑。
6.3 保存
7 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》"．