3 概述
Coons等於1941年首次採用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱爲熒光抗體技術（fluorescentantibodytechnique）。熒光免疫技術是標記免疫技術中發展最早的一種。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。
由於一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用於定量測定有一定困難。近年來發展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨牀檢驗中應用。
4 熒光現象
4.1 熒光的產生
一此化學物質能從外界吸收並儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發態，當其從激發態再回復到基態時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發光）。
熒光發射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量後即刻引起發光；而一旦停止供能，發光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失。
可以引起發熒光的能量種類很多，由光激發所引起的熒光稱爲致熒光。由化學應所引起的稱爲化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱爲X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。
4.2 熒光效率
熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發射熒光光量子的數值成正比。
熒光效率＝發射熒光的光量分子數（熒光強度）／吸收光的光量子數（激發光強度）
發射熒光的光量子數亦即熒光強度，除受激發光強度影響外，也與激發光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有最大吸收峯和最大發射峯。選擇激發光波長量接近於熒光分子的最大吸收峯波長，且測定光波量接近於最大發射光波峯時，得到的熒光強度也最大。
4.3 熒光的猝滅
熒光分子的輻射能力在受到激發光較長時間的照射後會減弱甚至猝滅，這是由於激發態分子的電子不能回覆到基態，所吸收的能量無法以熒光的形式發射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術中常用一些非熒的色素物質如亞甲藍、鹼性復紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染，以減弱非特異性熒光本質，使特異熒光更突出顯示。
5 熒光物質
5.1 熒光色素
許多物質都可產生熒光現象，但並非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光並能作爲染料使用的有機化合物才能稱爲免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）爲黃色或橙黃色結晶粉末，易溶於水或酒精等溶劑。分子量爲389.4，最大吸收光波長爲490495nm，最大發射光波長520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：
有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗乾燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較爲敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少於紅色。
2．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）爲橘紅色粉末，不溶於水，易溶於酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。結構式如下：
最大吸收光波長爲570nm，最大發射光波長爲595～600nm，呈橘紅色熒光。
3．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：
最大吸引光波長爲550nm，最大發射光波長爲620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用於雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。
5.2 其他熒光物質
1．酶作用後產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，後者可發出熒光，激發光波長爲360nm，發射光波長爲450nm。其他如鹼性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經激發後也可發射特徵性的熒光，其中以Eu3+應用最廣。Eu3+螯合物的激發光波長範圍寬，發射光波長範圍窄，熒光衰變時間長，最適合用於分辨熒光免疫測定。
6 熒光抗體的製備
6.1 抗體的熒光素標記
用於標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經純化提取IgG後再作標記。作爲標記的熒光素應符合以下要求：①應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合後不易解離，而未結合的色素及其降解產物易於清除。②熒光效率高，與蛋白質結合後，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質結合後不影響蛋白質原有的生化與免疫性質。⑤標記方法簡單、安全無毒。⑥與蛋白質的結合物穩定，易於保存。
常用的標記蛋白質的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC標記爲例，攪拌標記法爲：先將待標記的蛋白質溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸鹽緩衝液平衡，隨後在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續攪拌4～6h後，離心，上清即爲標記物。此法適用於標記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優點是標記時間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當會引起較臺強的非特異性熒光染色。
透析法適用於標記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標記比較均勻，非特異染色也較低。方法爲：先將待標記的蛋白質溶液裝入透析袋中，置於含FITC的0.01mol/LpH9.4碳酸鹽緩衝液中反應過夜，以後再對PBS透析法去除遊離色素。低速離心，取上清。
標記完成後，還應對標記抗體進一步純化以去除未結合的遊離熒光素和過多結合熒光素的抗體。純化方法可採用透析法或層析分離法。
6.2 熒光抗體的鑑定
熒光抗體在使用前應加以鑑定。鑑定指標記包括效價及熒光素與蛋白質的結合比率。抗體效價可以用瓊脂雙擴散法進行滴定，效價大於1:16者較爲理想。熒光素與蛋白質結合比率（F/P）的測定和計算的基本方法是：將製備的熒光抗體稀釋至A2801≈1.0，分別測讀A280（蛋白質特異吸收峯）和標記熒光素的特異吸收峯，按公式計算。
F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用於固定標本的熒光抗體以F/P＝1.5爲宜，用於活細胞染色的以F/P＝2.4爲宜。
抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標抗體的滴定。將熒光抗體自1:4～1:256倍比稀釋，對切片標本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度爲熒光抗體工作濃度。
熒光抗體的保存應注意防止抗體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝，－20℃凍存，這樣就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。
7 免疫熒光顯微技術
免疫熒顯微技術的基本原理是：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去遊離的熒光抗體後，於熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。
7.1 標本的製作
熒光顯微技術主要靠觀察切片標本上熒光抗體的染色結果作爲抗原的鑑定和定位。因此標本製作的好壞直接影響到檢測的結果。在製作標本過程中應力求保持抗原的完整性，並在染色、洗滌和封埋過程中不發生溶解和變性，也不擴散至臨近細胞或組織間隙中去。標本切片要求儘量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標本中干擾抗原抗體反應的物質要充分洗去，有傳染性的標本要注意安全。
常見的臨牀標本主要有組織、細胞和細菌三大類。按不同標本可製作塗片、印片或切片。組織材料可製備成石蠟切片或冷凍切片。石蠟切片因操作煩瑣，結果不穩定，非特異反應強等已少應用。組織標本也可製成印片，方法是用洗淨的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上1～2層組織細胞。細胞或細菌可製成塗片，塗片應薄而均勻。塗片或印片製成後應迅速吹乾、封裝。置－10℃保存或立即使用。
7.2 熒光抗體染色
於已固定的標本上滴加經適當稀釋的熒光抗體。置溼盒內，在一定溫度下溫育一定時間，一般可用25～37℃30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜爲宜。用PBS充分洗滌，乾燥。
7.3 熒光顯微鏡檢查
經熒光抗體染色的標本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結果。
熒光顯微鏡檢查應在通風良好的暗室內進行。首先要選擇好光源或濾光片。濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。在光源前面的一組激發濾光片，其作用是提供合適的激發光。激發濾光片有兩種。MG爲紫外光濾片，只允許波長275～400nm的紫外光通過，最大透光度在365nm；BG爲藍紫外光濾片，只允許波長325～500nm的藍外光通過，最大透光度爲410nm。靠近目鏡的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑制濾光片）的作用是濾除激發光，只允許熒光通過。透光範圍爲410～650nm，代號有OG（橙黃色）和GG（淡綠黃色）兩種。觀察FITC標記物可選用激發濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標記物時，可選用BG12與OG5配合。
7.4 實驗的類型
1．直接法用特異熒光抗體直接滴加於標本上，使之與抗原發生特異性結合（圖17-1）。本法操作簡便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點是敏感度偏低，每檢查一種抗原需製備相應的特異熒光抗體。
2．間接法可用於檢測抗原和抗體，原理見圖17-2。本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體爲針對抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體）爲針對第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。
3．補體結合法本法是間接法的第一步抗原抗體反應時加入補體（多用豚鼠補體），再用熒光標記的抗補體抗體進行示蹤（圖17-3）。本法敏感度高，且只需一種抗體。但易出現非特異性染色，加之補體不穩定，每次需採新鮮豚鼠血清，操作複雜。因此較少應用。
4．標記法本法用FITC及羅丹明分別標記不同的抗體，而對同一標本作熒光染色。在有兩種相應抗原存在時，可同時見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。
8 熒光抗體技術在醫學檢驗中的應用
熒光抗體技術在臨牀檢驗上已用作細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等。在細菌學檢驗中主要用於菌種的鑑定。標本材料可以是培養物、感染組織、病人分泌排泄物等。本法較其他鑑定細菌的血清學方法速度快、操作簡單、敏感性高，但在細菌實驗診斷中，一般只能作爲一種補充手段使用，而不能代替常規診斷。熒光抗體染色法對腦膜炎奈氏菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、布氏桿菌和炭疽桿菌等的實驗診斷有較好效果。熒光間接染色法測定血清中的抗體，可用於流行病學調查和臨牀回顧診斷。免疫熒光用於梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷常用方法之一。免疫熒光技術在病毒學檢驗中有重要意義，因爲普通光學顯微鏡看不到病毒，用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。
在寄生蟲感染診斷中，間接熒光抗體染色法有非常廣泛的應用。間接免疫熒光試驗（IFAT）是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。常用抗原爲瘧疾患者血液中紅內期裂殖體抗原。IFAT對腸外阿米巴、尤其是阿米巴肝膿腫也有很高的診斷價值，所用抗原是阿米巴培養物懸液或提取的可溶性抗原。
免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中應用廣泛。其突出優點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應的組織成分，並能在同一組織中同時檢查抗不同組織成分的抗體。主要有抗核抗體、抗平滑肌抗體和抗線粒體抗體等。抗核抗體的檢測最常採用鼠肝作核抗原，可做成冰凍切片、印片或勻漿。用組織培養細胞如Hep-2細胞或Hela細胞塗片還可檢出抗着絲點抗體、抗中性粒細胞漿抗體等。應用免疫熒光技術可以檢出的其他自身抗體有抗（胃）壁細胞抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺微粒體抗體、抗骨髓肌抗體及抗腎上腺抗體等。
熒光抗體技術的一種特殊應用是流式細胞分析（flowcytometry）。在這種分析方法中檢測儀器不是熒光顯微鏡，檢測對象不是固定了的標本，而是將遊離細胞作熒光抗體特異染色後，在特殊設計的儀器中通過噴嘴逐個流出，經單色激光照射發出的熒光信號由熒光檢測計檢測，並自動處理各處數據。這種方法可用於檢測細胞大小、折散率、粘滯度等，更常用於T細胞亞羣等的檢測。