7 脫氧核糖核酸染色的原理
末端脫氧核糖核酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)是一種細胞內酶,催化細胞的脫氧核苷酸,使其轉移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3'-OH端而無需模板指導。兔抗牛TdT抗體能和人細胞的TdT產生交叉反應,可採用免疫熒光技術或酶標免疫細胞化學技術用辣根過氧化酶-抗酶複合物(PAP immunocomplex)在細胞塗片或組織切片上定位顯示細胞內的TdT。
8 試劑
(1)正常兔血清IgG。
(2)免抗牛TdT抗體1∶8稀釋。
(3)羊抗兔IgG 1∶10稀釋。
(4)PAP免疫複合物(PAP immunocomplex from rabbit)1∶20稀釋。
(5)二氨基聯苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)溶液0.05mol/L Tris-HCl-9g/L NaCl液(pH7.4)100ml,含過氧化氫(V/V)爲0.03%,4℃保存,用前加入30mg DAB,溶解後過濾,立即避光使用。
9 操作方法
(1)新鮮抗凝血標本,用比重1.077的淋巴細胞分離液作密度梯度分離,取淋巴細胞層細胞離心塗片,空氣乾燥。或不作細胞分離,直接塗片。
(2)塗片用過氧化氫-甲醇液於4℃下固定20~30min,以阻斷細胞的內源性過氧化酶。
(3)塗片在0.1mol/L磷酸鹽緩衝液中浸泡15min,滴加正常兔血清,以減少抗體非特異性結合。
(4)滴加兔抗牛TdT抗體,37℃保溫30min。
(5)滴加羊抗兔IgG抗體,37℃保溫30min。
(6)滴加PAP免疫複合物,37℃保溫30min。
(7)將塗片浸入DAB溶液,室溫作用5~10min。
(8)水洗5min,幹後鏡檢,或用哈氏蘇木素染液復染胞核10min。