1 拼音
GBZ/T 240.13—2011 huà xué pǐn dú lǐ xué píng jià chéng xù hé shì yàn fāng fǎ dì 13bù fēn ：bǔ rǔ dòng wù jīng yuán xì bāo /chū jí jīng mǔ xì bāo rǎn sè tǐ jī biàn shì yàn
2 英文參考
Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 13:Mammalian spermatogonium/primary spermatocyte chromosome aberration test
ICS 13.100
C 52
中華人民共和國國家職業衛生標準 GBZ/T 240.13—2011《化學品毒理學評價程序和試驗方法 第13部分：哺乳動物精原細胞/初級精母細胞染色體畸變試驗》（Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals— Part 13:Mammalian spermatogonium/primary spermatocyte chromosome aberration test）由中華人民共和國衛生部於2011年08月19日發佈，自2012年03月01日起實施。
3 前言
根據《中華人民共和國職業病防治法》制定本部分。
GBZ/T 240《化學品毒理學評價程序和試驗方法》現分爲以下四十四部分：
——第1部分：總則；
——第2部分：急性經口毒性試驗；
——第3部分：急性經皮毒性試驗；
——第4部分：急性吸入毒性試驗；
——第5部分：急性眼刺激性/腐蝕性試驗；
——第7部分：皮膚致敏試驗；
——第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗；
——第13部分：哺乳動物精原細胞/初級精母細胞染色體畸變試驗；
——第15部分：亞急性經口毒性試驗；
——第16部分：亞急性經皮毒性試驗；
——第17部分：亞急性吸入毒性試驗；
——第18部分：亞慢性經口毒性試驗；
——第19部分：亞慢性經皮毒性試驗；
——第20部分：亞慢性吸入毒性試驗；
——第21部分：致畸試驗；
——第22部分：兩代繁殖毒性試驗；
——第24部分：慢性經口毒性試驗；
——第25部分：慢性經皮毒性試驗；
——第27部分：致癌試驗；
——第28部分：慢性毒性/致癌性聯合試驗；
——第29部分：毒物代謝動力學試驗；
——第33部分：果蠅伴性隱性致死試驗；
——第35部分：體外哺乳動物細胞程序外DNA合成（UDS）試驗；
——第42部分：一代繁殖試驗；
本部分爲GBZ/T 240的第13部分。
本部分由衛生部職業衛生標準專業委員會提出。本部分由中華人民共和國衛生部批准。
本部分起草單位：湖南省勞動衛生職業病防治所、中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所。本部分主要起草人：陸丹、許建寧、孫金秀、史曉禕。
5 2 規範性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GBZ/T 224 職業衛生名詞術語
6 3 術語和定義
GBZ/T 240.1確立的術語和定義適用於本文件。
3.1
精原細胞 spermatogonium
3.2
初級精母細胞 primary spermatocyte
精母細胞：精細胞的親代細胞。精母細胞有絲分裂產生的並能進入減數分裂細胞。
3.3
染色單體型畸變 chromatid-type aberration
3.4
染色體型畸變 chromosome-type aberration
在兩個染色單體的相同位點均出現斷裂或斷裂重組等改變的結構性損傷。
3.5
裂隙 gap
染色體或染色單體損傷的長度小於一個染色單體的寬度，爲染色單體的最小的錯誤排列。
3.6
染色體數目畸變 chromosomal numerical aberration
3.7
多倍體 polyploidy
哺乳動物染色體數目正常是二倍體，在化學誘變劑的作用下，染色體數目成倍地增加成三倍體、四倍體等。
3.8
染色體結構的畸變 chromosomal structure aberration
8 5 試驗概述
動物通過適當的途徑接觸受試樣品，一定時間後處死動物。觀察睾丸精原細胞或初級精母細胞染色體畸變情況，以評價受試樣品對雄性生殖細胞的致突變性。
動物處死前，用細胞分裂中期阻斷劑處理，處死後取出兩側睾丸，經低滲、固定、軟化及染色後製備精原細胞／初級精母細胞染色體標本，在顯微鏡下觀察中期分裂相細胞，分析精原細胞／初級精母細胞染色體畸變。
9 6 試驗方法
9.1 6.1 試劑
6.1.3 60%冰乙酸。
6.1.5 姬姆薩（Giemsa）染液：
Giemsa染料 3.8 g
甲醇 375 mL
甘油 125 mL
配製：將Giemsa染料和少量甲醇於乳鉢裏仔細研磨，再加入甲醇至375 mL，待完全溶解後，再加入125 mL甘油，混合均勻。置37℃恆溫箱中保溫48 h。保溫期間振搖數次，促使染料的充分溶解。取出過濾，兩週後使用。
1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉（Na2HPO4）9.47 g溶於1000 mL蒸餾水中。 1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀（KH2P04）49.07 g溶於1000 mL蒸餾水中。
取1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液50 mL與1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液50 mL混合。
6.1.7 Giemsa應用液：取1份Giemsa染液與9份1/15 mol/L磷酸鹽緩衝液混合而成。臨用時配製。
9.2 6.2 受試樣品處理
受試樣品一般應新鮮配製。如溶液貯存穩定，可以不必新鮮配製。固體受試樣品應溶於或懸於適當的溶劑或載體中，並進行稀釋。液體受試樣品可直接使用或稀釋後使用。根據受試樣品的理化性質[水溶性和（或）脂溶性]確定受試樣品所用的溶劑或載體。但所用溶劑或載體在使用劑量水平對實驗動物應不產生毒作用，且不與受試樣品發生任何化學反應。通常用蒸餾水、等滲鹽水、植物油、食用澱粉、羧甲基纖維素鈉等。如非常用的溶劑或載體，應有參考資料說明其成分。
9.3 6.3 對照
6.3.1 每次試驗都應設置相應的陽性和陰性對照（溶劑或載體）。陰性對照組除不使用受試樣品外，其他處理與受試樣品組一致。陰性對照由溶劑或載體組成。是否在每個採樣時間點均設置陰性對照，可依據動物間的變異和歷史對照資料中的精原細胞／初級精母細胞染色體畸變頻率判斷。如果採用一個採樣時間點作陰性對照，最適採樣時間點是第一採樣時間點。另外，如果沒有歷史對照資料證明所用溶劑或載體無誘導染色體缺失等效應，還應設空白對照。
6.3.2 陽性對照組動物體內應能形成可被檢測的高於背景的精原細胞／初級精母細胞染色體結構畸變。陽性對照組劑量設置應使致染色體畸變效應明顯，但不能使看片者一看即知編碼玻片底細。可只取一個採樣時間點來證明陽性對照。最好使用與受試樣品化學分類相關的陽性對照化合物。常用的陽性對照物有：
——環磷酰胺（cyclophosphamide，CAS號50-18-0）；
——單水環磷酰胺（cyclophosphamide monohydrate，CAS號6055-19-2）；
——絲裂黴索C（mitomycin C，CAS號50-07-7）；
——丙烯酰胺單體（monomeric acrylamide，CAS號79-06-1）；
——三亞乙基嘧胺（triethylenemelamine，CAS號51-18-3）。
由於本試驗中動物個體之間可能出現反應的變異較大，提倡試驗時陽性對照組不應只設一個劑量水平。
9.4 6.4 實驗動物和飼養環境
9.4.1 6.4.1 實驗動物
雄性小鼠和中國倉鼠是精原細胞／初級精母細胞染色體畸變試驗常規使用動物，其他合適的雄性哺乳動物也可選用。應使用健康年輕的性成熟動物，如使用小鼠，周齡7周～12周爲最好。所用動物體重變化按性別不能超過平均體重的20%。動物應隨機分組，每個處理組和對照組都必須有至少5只能用於分析的動物。如試驗設有幾個採樣時間點，則要求每組每個採樣時間點都有5只能用於分析的動物。動物購回後應適應實驗室新環境至少3 d～5 d。
9.4.2 6.4.2 飼養環境
動物應按組分籠飼養，每籠動物數以不干擾動物活動和觀察反應爲度。動物實驗室、實驗動物和動物飼料應符合國家相應規定。
9.5 6.5 劑量設計
9.5.1 6.5.1 精原細胞
應進行預試驗以選擇高劑量，只要在試驗中能證明有陽性效應，則劑量範圍偏大也可接受。如果受試樣品具有毒性，應在第一個採樣時間點設置三個可供分析的劑量，這些劑量應包括從最大毒性至低毒性或無毒性的範圍；第二次採樣時間點僅需設置高劑量。高劑量應是能使動物出現嚴重中毒反應的劑量，即最大耐受劑量。而有特異生物學活性的物質，如毒性很低（如激素和絲裂源）可另循其他劑量設置標準。高劑量也可是使精原細胞產生明顯毒性的劑量（如精原細胞有絲分裂中期相與第一次和第二次
減數分裂中期相的比率降低，但這種比率的降低不應超過50%）。一般可選急性經口1/2 LD50爲高劑量組。按等比級數2向下設置中、低劑量組。
9.5.2 6.5.2 初級精母細胞
應進行預試驗以選擇高劑量，只要在試驗中能證明有陽性效應，則劑量範圍偏大也可接受。如果受試樣品具有毒性，應設置三個可供分析的劑量，這些劑量應包括從最大毒性至無毒性的範圍。高劑量是指能使動物出現嚴重中毒反應的劑量，即最大耐受劑量。按等比級數2向下設置中、低劑量組。
9.5.3 6.5.3 限量試驗
如果試驗在不低於2000 mg/kg體重劑量水平，用同一日內進行一次或兩次染毒時沒有產生可觀察到的毒性效應，並且根據結構相似物質的資料也不能推斷受試樣品有遺傳毒性，則可不必考慮在整個試驗中設置三個劑量水平。若受試樣品毒性很低，應以5000 mg/kg體重劑量水平進行限度試驗，外推到人羣暴露的閾劑量試驗可能需要採用更高的劑量水平。
9.6 6.6 試驗步驟
9.6.1 6.6.1 實驗動物的處理和採樣時點
6.6.1.1 根據試驗目的或受試樣品的性質選擇染毒途徑，首選經口灌胃染毒。也可選擇腹腔注射等方式染毒。
6.6.1.2 受試樣品溶液一次給予的最大容量不應超過20 mL/kg。
6.6.1.3 一般情況下染毒一次，其劑量應引起明顯毒性。爲便於大容量給藥，也可分散劑量染毒，即同一日染毒2次，其間隔時間不超過幾小時。
6.6.1.4 精原細胞採集 高劑量組動物分爲A、B兩個亞組，分兩次採集樣品，A組於末次染毒後24 h採集樣品。B組於末次染毒後48 h採集樣品；中、低劑量組均於末次染毒後24 h採集樣品。
6.6.1.5 初級精母細胞採集 連續染毒5d，每天一次，於第一次染毒後的第12天～第14天採集樣品。
6.6.1.6 於處死動物採集樣品前3 h～6 h腹腔注射秋水仙素（4 mg/kg～6 mg/kg）。
9.6.2 6.6.2 精原細胞／初級精母細胞染色體標本製備
9.6.2.1 6.6.2.1 取材
用頸椎脫臼法處死動物，打開腹腔，迅速取出兩側睾丸，去除脂肪，稱重，置於盛有適量1%檸檬酸三鈉溶液的小平皿中，洗去毛和血污，轉入另一小平皿中。
9.6.2.2 6.6.2.2 低滲
6.6.2.2.1 精原細胞。取出睾丸，去除被膜，分離曲細精管。加入預溫（37℃）的1%檸檬酸三鈉溶液（低滲液）5 mL。倒入10 mL試管，加低滲液至10 mL，用滴管吹打混懸曲細精管，靜止2 min，使曲細精管下沉。將含有許多精子和減數分裂的上清液仔細吸去，留下的曲細精管，重新用10 mL低滲液處理10 min～20 min。
6.6.2.2.2 初級精母細胞。取出睾丸，去除被膜，分離曲細精管。加入4℃冰箱保存的1%檸檬酸三鈉溶液10 mL。用滴管吹打混懸曲細精管，靜置20 min。
9.6.2.3 6.6.2.3 固定
用滴管儘量吸去上清液，加入10 mL固定液混勻，固定30 min，如在冰箱（0℃～4℃）過夜固定則更好。
9.6.2.4 6.6.2.4 離心
以1000 r/min速度離心10 min。
9.6.2.5 6.6.2.5 軟化
用滴管吸盡上清液。加入60%冰乙酸2 mL，滴管吹打至不透光。
加入2 mL新鮮固定液，用細口滴管充分混勻。
9.6.2.6 6.6.2.6 製片
在潔淨的冷凍玻片上滴3滴～4滴細胞懸液，輕吹細胞懸液擴散平鋪於玻片上。將玻片在酒精燈上微熱烘乾。每個睾丸製片2張～3張。
9.6.2.7 6.6.2.7 染色
將製備好的標本片放入Giemsa應用液中染色10min～20 min，用蒸餾水沖洗、晾乾。
9.7 6.7 閱片
9.7.1 6.7.1 標本片編號
9.7.2 6.7.2 標本片閱檢
在低倍鏡下尋找背景清晰、分散良好、染色體收縮適中的中期分裂相，在油鏡下注意選取細胞膜形態完整、鄰近無遊離染色體或中期相的細胞進行觀察。
9.7.3 6.7.3 有絲分裂指數（僅限於精原細胞）
對各處理組、陰性對照組和陽性對照組，每隻動物計數1000個細胞測定有絲分裂指數，以確定細胞毒性。
9.7.4 6.7.4 計數畸變細胞
用雙盲法閱片。每隻動物做兩側睾丸，每側睾丸至少分析50個精原細胞／初級精母細胞中期分裂相，即每個劑量組至少觀察500個中期分裂相。當觀察到的畸變細胞數量較多時，可以減少觀察的細胞數。在閱片時應記錄每一觀察細胞染色體畸變的數目和類型以及顯微鏡視野的座標位置。
9.7.5 6.7.5 觀察項目
9.7.5.1 6.7.5.1 精原細胞
6.7.5.1.1 染色體數目的改變：多倍體。正常精原細胞中期分裂相中常可見到多倍體，這是因爲精原細胞至少兩次有絲分裂和它們子細胞的減數分裂常同步進行。可以有兩個或四個中期分裂相彼此極靠近，看來像一個中期相。因此闡明生殖細胞多倍體的意義時應很慎重，僅在第一次減數分裂中，四倍體生殖細胞有一個被確認爲四價體時纔有意義。
6.7.5.1.2 染色體結構的改變：斷裂、斷片、微小體、無着絲點環、環狀染色體、雙或多着絲點染色體、單體互換等。
9.7.5.2 6.7.5.2 初級精母細胞
10 7 數據處理與結果評價
10.1 7.1 數據處理
每一實驗動物作爲一個觀察單位。精原細胞試驗每組動物分別計算染色體結構畸變細胞百分率。一般用x2檢驗方法進行統計學分析。初級精母細胞受試樣品組與對照組的斷片、易位、畸變細胞率、常染色體單價體、性染色體單價體等分別按x2檢驗進行統計分析。兩種細胞染色體畸變的裂隙都應分別記錄和報告，但一般不計人總的畸變率。
10.2 7.2 結果評價
受試樣品組細胞染色體畸變率與陰性對照組相比，統計學意義上有顯著性差異，並有明確的劑量一反應關係或在一個受試樣品組出現染色體細胞畸變數明顯增高時，即可認爲精原細胞／初級精母細胞染色體畸變試驗陽性。若統計學上差異有顯著性，但無劑量一效應關係，則須進行重複試驗，結果能重複者可確定爲精原細胞／初級精母細胞染色體畸變試驗陽性。
11 8 評價報告
除GBZ/T 240.1規定的一般項目外，評價報告還應包括以下方面：
a） 劑量分組及選擇劑量的基本原則，陽性和陰性對照資料（包括當前和歷史的資料）、染毒途徑和方式，採樣時間點；
c） 試驗方法：簡述操作步驟，所用統計學方法，結果判定標準；
d） 結果：中毒症狀、每隻動物染色體畸變類型和畸變細胞數、每組動物細胞畸變總數、均數和標準差、每組每細胞各類型畸變數、劑量一反應關係、陰性對照的參考資料、歷史資料及範圍、均值和標準差、陽性對照的參考資料等。精原細胞還應包括：有絲分裂指數、精原細胞有絲分裂中期相與第一次和第二次減數分裂中期相的比率。以列表方式報告受試樣品組、溶劑對照組和陽性對照組動物精原細胞／初級精母細胞染色體畸變類型和數量及畸變率；
e） 結論。