4 概述
自然殺傷細胞又稱NK細胞,其主要的功能特徵是對腫瘤細胞及病毒感染細胞具有非特異性的殺傷力,這種殺傷效應不依賴抗體與補體,體外檢測NK細胞活性是診斷NK細胞功能及其與某些疾病關係的一個重要手段。
5 原理
5-125碘-2'-脫氧尿嘧啶核苷(125IUdR)分子上的碘原子與胸腺嘧啶核苷上的甲基在空間構型上類似,作爲DNA合成的前體物,125IUdR較特異的取代胸腺嘧啶核苷摻入到細胞核DNA鏈上。因此,可用於標記快速分裂的瘤細胞。當標記的腫瘤靶細胞被NK細胞攻擊死亡後,靶細胞內的125IUdR可釋放入培養液中,此釋放的同位素幾乎不再被活細胞利用。經用γ閃爍計數器測定cpm值,算出釋放率,以其釋放的百分率表示NK細胞的活性。
6 試劑
(1)淋巴細胞分層液、K562細胞株、5-FUdR和125IUdR、胰蛋白酶和DNA酶。
(2)效應細胞 靜脈血單個核細胞分離提取同K細胞測定方法,用RPMI 1640培養液洗滌2次,最後用該液配成1×107個/ml細胞懸液。
(3)標記靶細胞 用慢性骨髓性白血病母細胞K562株作爲靶細胞(此細胞可在液氮中長期貯存)。取一定量的靶細胞加入一定量的5-FUdR和125IU-dR,混勻置37℃培育2h,然後用培養液洗3次,配成1×105個/ml,檢測細胞標記率,要求2cpm/每個細胞。
7 操作方法
(1)效靶細胞作用:將分離好的淋巴細胞懸液(效應細胞)和標記的K562細胞(靶細胞)按100∶1的比例加入平底塑料試管中,按表1操作,同時設自然釋放管(作爲對照管),每個標本作了3個復管,最後用培養液使每管增至1ml,1500r/min離心,促進效靶細胞結合,置37℃、5% CO2孵箱內孵育18h。
(2)酶促反應:取出孵育試管,棄去各管上清液,剩下的細胞加一定濃度(2.2g/L)胰蛋白酶和DNA酶各0.1m1,混勻後37℃水浴30min,促使被攻擊的靶細胞釋放125IUdR,隨後各管立即加入0.8ml Hank液終止酶促反應。混勻後1500r/min離心2min。
(3)測放射強度和計算:用γ型計數器分別測各管(上清和細胞管)cpm值,按下式計算;