2 英文參考
Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of γ-Glutamyltransferase
《γ-谷氨酰基轉移酶催化活性濃度測定參考方法》由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會於2013年7月16日發佈，自2013年12月1日起實施。
ICS 11. 020
C 50
中華人民共和國衛生行業標準
WS/T 417—2013
Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of γ-Glutamyltransferase
3 前言
本標準按照GB/T 1.1-2009給出的規則起草。
本標準參考了國際檢驗醫學溯源聯合委員會（JCTLM）批准的《IFCC在37℃酶催化活性濃度測定原級參考方法 第6部分：γ——谷氨酰基轉移酶催化濃度測定參考方法》。
本標準起草單位：首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院、衛生部臨牀檢驗中心、北京協和醫院。
本標準主要起草人：張曼、遲珊、王京、賈汝靜、沈默、張傳寶、邱玲、楊振華。
4 1 範圍
本標準規定了在臨牀醫學應用中，測定γ一谷氨酰基轉移酶（γ-GT）催化活性濃度的參考方法。
本標準適用於參考實驗室和臨牀實驗室作爲γ一谷氨酰基轉移酶活性濃度測定的溯源標準，也適用於與酶活性濃度檢驗有關的儀器和試劑生產企業、有關評價單位及質量管理部門。
5 2 術語和定義
下列術語和定義適用於本文件。
2.1
原始樣本 primary sample
最初從一個系統中取出的一個或幾個部分的集合物，旨在提供該系統的信息或作爲對該系統做出決定的基礎。
注：在某些情況下，所提供的信息可以適用於一個較大的系統或一組系統，此時取樣系統是這些系統的組成部分。
2.2
實驗室樣本 laboratory sample
準備送到實驗室或實驗室接收的用於測定的原始樣本或原始樣本的分樣本。
2.3
分析樣本 analytical sample
2.4
分析部分 analytical portion
從分析樣本中取出的用於實際測定和觀察的物質部分。
注：如果不需預處理，分析部分直接從原始樣本或實驗室樣本中取出。某些情況下．需將分析部分溶解成分析溶液再上機測定。
2.5
分析溶液 analytical solution
將分析部分溶解在氣體、液體或固體中而製備的溶液，溶解過程中可以有反應發生或無反應發生。
2.6
（某一物質系統的）基質 matrix（of a material system）
2.7
參考測定方法 reference measurement procedure
在校準或表徵標準物質時爲提供測定結果所採用的測定方法，適用於評定由同類量的其他測定方法獲得的被測定量值的測定正確度。
2.8
被測量 measurand
擬測定的量。
示例1：用較小內阻的電壓表測定電池兩端之間的電位差，開路電位差可從電池和電壓表的內阻計算得到。
示例2：在平衡到環境溫度23℃時鋼棒長度與在特定溫度20℃時測定得到的長度有差別，這種情況下應加以修正。
示例3：在化學中，“分析物”或者物質或化合物的名稱有時被稱作“被測量”。這種用法是錯誤的，因爲這些術語並不涉及到量。
注1：對被測量的說明要求瞭解量的種類，以及含有該量的現象、物體或物質狀態的描述，包括有關成分及所涉及的化學實體。
注2：在VIM第二版和IEC 60050-300：2001中，被測量定義爲受到測定的量。
注3：測定包括測定系統和實施測定的條件，它可能會改變研究中的現象、物體或物質，使被測定的量可能不同於定義的被測定。在這種情況下·適當的修正是必要的。
2.9
檢出限 detection limit，limit of detection
由給定測定方法獲得的測得值，其聲稱的物質成分不存在的誤判概率爲β，聲稱物質成分存在的誤判概率爲α。
注1：國際理論和應用化學聯合會（IUPAC）推薦α和β的默認值爲0.00.
注2：有時使用縮寫詞LOD。
2.10
校準品 calibrator
用於校準的測定標準。
6 3 縮略語
下列縮略語適用於本文件。
GUM：測量不確定度表示指南（Guide to the expression of uncertainty in measurement）
IFCC：國際臨牀化學與檢驗醫學聯合會（International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine）
QUAM：分析測量中不確定度的量化（Quantifing Uncertainty in Analytical Measurement）
SOP：標準操作程序（Standard Operation Procedure）
7 4 參考方法描述
7.1 4.1 測定原理和方法
L-γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺+甘氨酰甘氨酸
5-氨基-2-硝基苯甲酸酯+L—γ-谷氨酰基-甘氨酰甘氨酸
上述反應中5-氨基-2-硝基苯甲酸酯的生成速率與γ-谷氨酰基轉移酶活性成正比，在37℃，410 nm波長下測定5-氨基-2-硝基苯甲酸酯的吸光度變化率，可計算γ—谷氨酰基轉移酶催化活性。
注：總底物中大約有l%按下列方式自動轉化：
L-γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺+L-γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺5一氨基-2-硝基苯甲酸酯+L-γ-谷氨酰基-γ一谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺
7.2 4.2 檢查列表
4.2.1 試劑列表
所用試劑見表1。
表1 γ-GT試劑列表
4.2.2 分光光度計和輔助儀器列表
參考實驗室應登記主要測定儀器[分光光度計]和主要輔助儀器【點式溫度計、天平.pH計、恆溫水浴箱、稀釋配液儀、移液器等]，見表2。
表2 分光光度計和輔助儀器
7.3 4.3 試劑
7.3.1 4.3.1 試劑原料信息
4.3.1.1 按表3詳細填寫試劑原料信息。
表3 試劑原料詳細信息
4.3.1.2 γ-GT測定所用每個試劑原料詳細信息見附錄A，應該使用最高純度的試劑。如懷疑一種化學藥品含有不純的物質影響了分析物的催化活性，必須進行進一步的研究，例如，比較不同廠家和不同批號的產品。建議使用在對比試驗中已經鑑定或認可的試劑。
4.3.1.3根據IFCC參考方法（30℃），底物N一甘氨酰甘氨酸中所含雜質甘氨酸應該小於0.001（質量比），L-γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺中所含L-α-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺應該小於0.005（質量比），所含5-氨基-2-硝基苯甲酸應小於0. 001（質量比）。如果N-甘氨酰甘氨酸和L-γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺的生產廠商不能提供上述物質的相關信息，試劑應該經參考方法（IFCC．30℃）中所述色譜分析法進行檢測。
a） 氫氧化鈉特性：
5） 本品不會燃燒，遇水和水蒸氣大量放熱，形成腐蝕性溶液。與酸發生中和反應並放熱。分解產物可能產生有害的毒性煙霧。
b） 防護措施：
2） 眼睛防護：戴化學安全防護眼鏡；
4） 手防護：戴橡皮手套。
7.3.2 4.3.2 試劑溶液
4.3.2.1 一般要求
配製試劑的試劑原料的純度應爲100%.如果試劑原料含量不足100%（例如，y），按公式（l）計算實際含量：
式中：
W實際——實際稱重量；
W理論——理論稱重量；
y，——試劑純度，%。
溶液的製備應使用質量與雙蒸水類似的高純度水（電導率<2 μS/cm，pH 6～7，硅酸鹽<0.1 mg/L）。
每次稱重的擴展（k=2）不確定度（包括物質純度的不確定度）（正態分佈），應≤1. 5%。
稱量2. 73 g N-甘氨酰甘氨酸，遊離鹼，將上述物質按以下步驟處理：
一溶解於約80 ml_水中；
一用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH（37℃）到7.7；
一轉移於100 mL容量瓶中；
一把容量瓶和水的溫度平衡到20℃；
一將水（20℃）加至容量瓶的校準刻度。
最終配製的溶液中N-甘氨酰甘氨酸，遊離鹼濃度爲206.3 mmol/L，該溶液2℃～8℃穩定性爲2周。
稱量0. 229 g L-γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺，單銨鹽，一水化合物，將上述物質按以下步驟處理：
一溶解於約15 mL水中；
一轉移於20 mL容量瓶中；
一把容量瓶和水的溫度平衡到20℃；
一將水（20℃）加至容量瓶的校準刻度。
最終配製的溶液中L-γ一谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺．單銨鹽，一水化合物濃度爲33.00 mmol/L．該溶液2℃～8℃穩定性爲1周。
7.3.3 4.3.3 溫度對緩衝溶液pH的影響
當溫度偏離37℃時，調節pH的方法：將溫度計與pH電極同時浸入混合液中。然後將溶液邊攪拌邊滴定至表中列舉在當前測定溫度下的pH。在校準、控制和調節pH的過程中，攪拌速度要一致，pH電極必須位於被攪拌溶液的中心。
必須考慮到在調節pH的滴定過程中，溫度是可能改變的因素。爲此，接近靶值時應重新控制溫度，如果需要，根據附錄B調整pH靶值，同樣的方法也適用於pH計的溫度補償調節。
配製溶液1時，應遵照附錄B的規定根據不同溫度調節溶液的pH。
7.4 4.4 儀器
分光光度計及輔助儀器主要性能的要求，見表4。
表4 分光光度計、輔助儀器主要性能的要求
7.5 4.5 採樣和樣本
4.5.1 通則
參考實驗室不自行採血，主要接受外檢標本，一般不需考慮分析前因素對樣本特性的影響。
4.5.2 對收檢樣本的要求
宜以表格形式記錄樣本的詳細信息，見表5。對不符合樣本收檢要求的樣本應及時與委託方聯繫。
表5 γ-GT收檢樣本要求
7.6 4.6 測定系統和分析部分的準備
7.6.1 4.6.1 測定系統的準備
4.6.1.1 分光光度計準備
測定前，按已制定的SOP文件對分光光度計進行檢查，並填寫表6。
表6 分光光度計準備
各實驗室可根據自己的實際情況設計操作流程圖。
4.6.1.2 點溫計準備
測定前，按已制定的SOP文件對點溫計進行檢查，並填寫表7。
表7 點溫計準備
各實驗室可根據自己的實際情況設計操作流程圖。
4.6.1.3 恆溫水浴箱準備
測定前，按已制定的SOP文件對恆溫水浴箱進行檢查，並填寫表8。
表8 恆溫水箱測定系統的準備
各實驗室可根據自己的實際情況設計操作流程圖。
4.6.1.4 稀釋配液儀準備（實驗室若有）
測定前，按已制定的SOP文件對稀釋配液儀進行檢查，並填寫表9。
表9 稀釋配液儀測定系統的準備
各實驗室可根據自己的實際情況設計操作流程圖。
4.6.1.5 移液器準備
測定前，按已制定的SOP文件對移液器進行檢查，並填寫表10。
表10 移液器測定系統的準備
各實驗室可根據自己的實際情況設計操作流程圖。
4.6.1.6 天平準備
測定前，按已制定的SOP文件對天平進行檢查，並填寫表11。
表11 天平準備
各實驗室可根據自己的實際情況設計操作流程圖。
4.6.1.7 pH計準備
測定前，按已制定的SOP文件對pH計進行檢查，並填寫表12。
表12 pH計準備
各實驗室可根據自己的實際情況設計操作流程圖。
7.6.2 4.6.2 分析部分的準備
4.6.2.1 分析樣本的類型
——參考物質（RM）；
——質控品；
——其他樣本。
分析樣本按下列順序排列：
——參考物質（RM）；
——質控品；
——被分析的“未知”物質。
上述樣本重複測定可減小測定結果不確定度，從一個樣本到下一個樣本的攜帶污染應小於0. 5%。
4.6.2.3 分析部分
γ-GT參考方法測定的樣本多爲凍乾粉或深低溫的冰凍樣本，測定前需處理爲均勻的液體狀態，分析部分應取自該液體樣本。實驗室需對待測的各種樣本經過一定程序處理後，取出分析部分進行定。對每一類型實驗室樣本應制定詳盡的樣本處理SOP文件，並有記錄證實操作達到預期要求。實驗室樣本若爲凍乾粉或乾粉，應使用質量與雙蒸水類似的高純度水（電導率<2 μS/cm，pH 6—7，硅鹽<0.1 mg/L）溶解；若爲冷凍液體如冰凍血清等，應按SOP文件在嚴格控制的條件下溶解。應有處理參考物質的程序和記錄。
測定過的樣本有貯存待複查、銷燬的文件和記錄。
7.7 4.7 酶催化活性濃度測定
7.7.1 4.7.1 測定條件
γ-GT催化活性濃度測定條件見表13。
表13 γ-GT催化活性濃度測定條件
7.7.2 4.7.2 測定步驟
4.7.2.1 監測比色杯內溫度，達到要求時開始準備試劑和分析溶液。
4.7.2.2 將一份適當體積（約0.8 mL）起始試劑溶液在37℃下平衡，剩餘的起始試劑必須保存在2℃～8℃。
4.7.2.3 將表14中所列試劑體積按圖1的流程進行加樣及測定。
表14 γ-GT的分析系統
圖1 γ-GT參考方法測定流程圖
7.7.3 4.7.3 終反應混和液濃度
終反應混和液濃度見表15。
表15 γ-GT催化活性濃度測定終反應混合液物的濃度
7.7.4 4.7.4 試劑空白率測定
用9 g/L （154 mmol/L） NaCI溶液代替樣本進行試劑空白率的測定。測定過程同上。一旦試劑空白率超過1.7×10-5/S（0.001/min）或出現負值，應該重複測定，必要時須棄去試劑溶液。
7.7.5 4.7.5 樣本空白率
測定樣本空白率用9 g/L （154 mmol/L） NaCI溶液代替起始反應液，以測定樣本空白率。測定過程同上。
注1：樣本空白率雖然可測定並記錄，但在計算質控血清和校準品γ-GT催化濃度時，不考慮樣本空白率。一旦樣本空白率超過總γ-GT的1%，則警告有關物質不適宜做校準用。
注2：由於反應混合物中γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺可被忽略，因此不考慮樣本基質對指示劑反應的影響。
7.7.6 4.7.6 結果確認
在進行重要測定前[如給參考物質／校準品賦值、測定室間比對標本等]，應先測定JCTLM或國家批准的參考物質，測定結果應在“靶值±不確定度”範圍內，否則應確認建立方法的正確性。
實驗室應有SOP文件和記錄證實此活動。
7.8 4.8 測定結果處理
7.8.1 4.8.1 測定結果計算及數據處理
4.8.1.1 計算
以監測時間爲X軸，吸光度爲Y軸作線性迴歸分析（最小二乘法）後計算吸光度變化率（吸光度是時間倒數的函數）。測定樣本吸光度變化率減去試劑空白吸光度變化率後得到實際的測定樣本吸光度變化率，再乘以係數F，具體計算按公式（2）。
式中：
bγ-GT————γ-GT催化濃度；
F=1 382（在410 nm測定，ε410（5-氨基-2-硝基苯甲酸）=796 m2/mol）；
————一實際的測定注：γ-GT催化濃度用μkat/L單位來計算，將催化活性濃度的單位μkat/L乘以係數f=60，可換算成U/L的形式。
4.8.1.2 數據處理
4.8.1.2.1 數據剔除：各實驗室應按照適當的規則進行數據剔除，如：若測定結果超過整組數據的均值±3SD，可以剔除。但剔除的測定結果數量應小於總測定次數的5%;如果測定次數爲10次～20次，則最多隻能剔除1個數據，否則應重新測定。
4.8.1.2.2 計算每批次測定值的均值、標準差，必要時應檢查數據分佈類型，計算均值的標準偏差（標準誤）。
4.8.1.2.3 根據GUM和QUAM原則計算測定結果不確定度。
7.8.2 4.8.2 酶活性單位及換算關係
酶催化活性常用單位爲kat/L，使用時常出現多位小數，目前常以μkat/L或nkat/L表示，但臨牀醫學中仍習慣於使用U/L。換算關係如下：
以U/L單位表示的催化濃度可通過乘以係數（f=0.01667）轉化成μkat/L。
7.9 4.9 分析可靠性
7.9.1 4.9.1 概念、價值及其應用
依據不確定度、精密度、線性範圍、檢出限等來評估γ-GT參考測定方法的分析可靠性。相關文獻及參考方法的實驗室測定數據表明本參考測定方法的分析性能優於臨牀酶活性濃度常規方法。適合於臨牀常規方法的溯源。
7.9.2 4.9.2 測定不確定度
應根據GUM和QUAM原則計算測定不確定度。γ-GT參考方法測定結果的相對合成標準不確定度在濃度1.67 μkat/L（100 U/L）時宜<2.0%。
7.9.3 4.9.3 精密度
應根據本實驗室測定條件評估建立的參考方法的重複性、復現性精密度。本參考方法測定1. 67 μkat/L（100 U/L）樣本的重複性精密度宜<1.5%．實驗室內復現性精密度宜<2.0%。
7.9.4 4.9.4 檢出限
與分光光度計的最小分析信號有關，本參考方法測定的最低檢出限爲0.08 μkat/L（5.0 U/L）。
7.9.5 4.9.5 線性範圍
線性範圍：<4. 56 μkat/L（273.6 U/L）。
7.9.6 4.9.6 誤差的來源
由於血清和起始反應液的高體積分數，因此只有樣本和底物溶液的溫度適當時，才能在測定開始時達到所需的測定溫度。一些質控樣本，如果在測定前已稀釋，測定中所測γ-GT催化濃度會偏離。因此樣本是否經過預稀釋應該預先說明。
7.10 4.10 實驗室間比對進行確認
γ-GT催化活性濃度參考測定方法由檢驗醫學國際權威學術組織IFCC提出，經多個參考實驗室認真評估後經JCTLM批准。早在20世紀70年代，IFCC經過實驗和討論，公佈了30℃測定本酶的參考測定方法，並應用於臨牀，鑑於臨牀生化分析儀廣泛應用37℃，IFCC在2002年頒佈了取代30℃的37℃的γ-GT原級參考測定方法，2002年得到JCTLM批准成爲正式國際參考測定方法。關於γ-GTIFCC37℃參考測定方法與30℃參考測定方法的比較參見附錄C。
JCTLM在2003年的國際參考實驗室能力比對計劃（RELA）中將本酶列爲比對項目之一。從歷年比對結果看，大多數參加實驗室測定結果都在均值±5.25%內，可確認此參考測定方法適合預期臨牀使用。經過廣泛確認可達到臨牀醫學特定應用的需要。
中國從2006年開始有6個實驗室參加此酶的RELA比對計劃，2009年增至14個實驗室。測定結果和國際一致。證實此參考測定方法可用於我國臨牀常規方法測定結果的溯源。
7.11 4.11 初步參考值
IFCC初步調查了男性（n=407）和女性（n=420）成年人羣（≥17歲）的初步參考區間，見表16。
表16 γ-GT催化活性濃度參考區間
7.12 4.12 報告
應設計適宜的測定結果報告格式，包括但不限於以下內容：
——取樣日期和測定日期；
——測定所使用的參考程序：IFCC在37℃下測定γ-GT催化活性濃度的原級參考方法；
——被測量的名稱：γ-GT；
——測定結果數字值；
——測定單位：μkat/L或U/L;
——評定測定不確定度的結果：一般取k=2;
7.13 4.13 質量保證
7.13.1 4.13.1 室內質量控制
每個工作日開始正式測定樣本前均測定質控品，當質控符合要求後才進入正式測定。質控品可選用校準品，建立包括質控規則、操作步驟的室內質控SOP文件及評價記錄。
7.13.2 4.13.2 室間質量控制
10 附錄C（資料性附錄）γ-GT IFCC 37℃參考測定方法與30℃參考測定方法的比較
一級參考方法是源自IFCC參考方法，該參考方法爲γ-GT催化活性濃度的測定提供了最佳條件。37℃取代30℃作爲測定溫度只需對某些測定參數進行微小的改變即可保留最適的測定條件，見表C.1。此外，如果與30℃的參考方法進行比較時，爲提高測定的高標準化，需要更準確的說明，此附錄也加以敘述。
表C.1 γ-GT IFCC方法在37℃和30℃測定溫度下的比較
表C.1（續）
11 參考文獻
[1] IS0 15193 :2009 In vitro diagnostic medical devices-Measurement of quantities in samples
of biological origin-Presentation of reference measurement procedures
[2] JCTLM;IFCC reference measurement procedure（37℃） for GGT. 2002
[3] BIPM/IEC/IFCC/ISO/IUPAC/IUPAP/OIML; Guide to the expression of uncertainty in measurement. GUM 1993
[4] EURACHE/CITAC;Quantifing Uncertainty in Analytical Measurement. QUAM 2000