3 概述
環鳥苷酸是由細胞內鳥苷三磷酸(GTP)經鳥苷酸環化酶催化所產生。目前認爲環鳥苷酸和環腺苷酸是相互拮抗的物質,在正常生理狀態下,組織或血漿中的環腺苷酸和環鳥苷酸濃度的比值保持相對恆定,在分析中往往同時測定這兩種物質的濃度,兩者比例失調是某些疾病發病機制的一項客觀指標。
5 尿環磷鳥苷的醫學檢查
5.1 檢查名稱
5.2 分類
5.3 化驗取材
5.4 尿環磷鳥苷的測定原理
[3H]-標記測定法:cGMP是繼cAMP之後1963年Price發現的另一種環核苷酸。其結構和cAMP基本相似,由鳥苷、核糖和磷酸所組成。測定原理也與cAMP相似,即樣品經預處理,將樣品和標準同時進行酰化反應,以改善抗體對待測物的親和力,提高測定方法的靈敏度。樣品和[3H]-ScGMP共同競爭性的與抗體結合,從標準劑量反應曲線計算出樣品中cGMP濃度。
5.5 試劑
(1)抗血清:以ScGMP-BSA結合物免疫動物獲得。與cAMP交叉反應爲零,滴度爲1∶12000。
(2)[3H]-cGMP:中國原子能研究院產品,比放射活性814GBq(22Ci)/mmol。4℃冰箱貯存。
(3)50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液:同[3H]-cAMP測定法。
(4)[3H]-ScGMP:取[3H]-cGMP 92.5kBq(2.5μCi)加至帶玻璃塞提取管中,加琥珀酸酐5mg,蒸餾水0.1ml。再加三乙胺10μl,即刻用力搖1~2min,加50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液10ml。臨用前配製。
(5)標準cGMP液(8nmol/ml):取AR級cGMP少許溶於雙蒸餾水中。在紫外分光光度計260nm(1cm比色杯)測A值。按照cGMP260nm的A值除以11.7即得cGMPmmol/L。再以蒸餾水稀釋8nmol/ml。
(6)標準cGMP(80pmol/瓶):取標準cGMP液10μl加至5ml瓶中,放37℃乾燥,加蓋密封放4℃保存。臨用前,取標準cGMP一瓶,加2ml 50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液溶解,爲S6。另取試管5只各加緩衝液0.5ml,從S6中吸出0.5至S5,依次倍比稀釋,此係列標準濃度100μl中含有4,2,1,0.5,0.25,0.125pmol。
(7)閃爍液:同[3H]-標記cAMP測定法。
5.6 操作方法
(1)樣品的採集和預處理:同[3H]-標記cAMP測定法。
(2)加液程序:取10mm×100mm玻璃試管,註明NSB、S0、S1~5和測定。按表1程序加入樣品和試劑。
(3)加[3H]-ScGMP和抗血清後,混勻,放4℃反應2.5h,每管補加冷50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液1ml,混合勻充。
(4)取硝酸纖維膜(上海化工研究院產品)浸於50mmol/L pH6.2醋酸鹽緩衝液中2h,然後放置在專用濾器上。將反應液滴加至濾膜上抽濾,再用1ml相同緩衝液洗反應管2次,亦加至濾膜上洗滌和抽濾。
(5)將濾膜放80℃ 30min乾燥。另取[3H]-ScGMP50μl滴至另一張乾燥濾膜上,作爲總計數(T)。
(6)將膜放至預先加5ml閃爍液的瓶中,放2~3h後測放射性。
(7)零標準淨計數B0,標準管淨計數爲B,以B0/B爲縱座標,標準管cGMP的Pmol爲橫座標,在普通座標紙作圖,在Y軸截距1處得出一條直線。依樣品管B0/B值,在標準劑量反應圖上得出相對應cGMP的值。再乘5得nmol/L。
5.7 正常值
0.22~0.68μmol/g·肌酐。
5.8 化驗結果臨牀意義
(1)升高:甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺功能亢進、肝硬化、惡性腫瘤。
5.9 附註
(1)目前中國原子能研究院提供的[3H]-cGMP系附着於濾紙條的乾燥品,不易直接精確取量,可將紙條浸於50%乙醇中,取一定量測放射性,根據閃爍液及儀器的測量效率由cpm換算成dpm,再由dpm換算成放射劑量。
(3)[3H]-標記測定法穩定性好,靈敏度略低於[125I]標記法。
(4)以ScGMP-BSA免疫動物所製備的抗體,其親和力對ScGMP比cGMP約高兩個數量級,故樣品,標準和[3H]-標記物要經琥珀酰或乙酰化反應處理。以提高測定方法的靈敏度。