WS/T 42—1996 血中碳氧血紅蛋白的分光光度測定方法

1 拼音

WS/T 42—1996 xuè zhōng tàn yǎng xuè hóng dàn bái de fēn guāng guāng dù cè dìng fāng fǎ

2 英文參考

Blood—Determination of carboxyhemoglobin—Spectrophotometric method

中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 42—1996《血中碳氧血紅蛋白的分光光度測定方法》（Blood—Determination of carboxyhemoglobin—Spectrophotometric method）由中華人民共和國衛生部於1996年10月14日發佈，自1997年05月01日起實施。

3 1 主題內容與適用範圍

本標準規定了血中的碳氧血紅蛋白的分光光度測定方法。

本法最低檢測濃度爲2%HbCO。

本標準適用於正常人和接觸一氧化碳工人血中HbCO濃度的測定。

4 2 原理

血液中含有四種血紅蛋白成分，即還原血紅蛋白（Hb）、氧合血紅蛋白（HbO₂）、碳氧血紅蛋白（HbCO）及微量的變性血紅蛋白（MetHb）．用連二亞硫酸鈉將HbO₂和MetHb還原成Hb，則血液中只存在HbCO（Ⅰ）和Hb（Ⅱ）兩種成分。Ⅰ的最大吸收波長在420 nm,Ⅱ的最大吸收波長在430 nm。測出被檢血樣在兩個波長的吸光度，再利用Ⅰ與Ⅱ在兩個波長下的摩爾吸光係數計算HbCO的百分濃度。

5 3 儀器

3.1 分光光度計，10 mm比色杯。

3.2 液體快速混合器。

3.3 採血吸管。

3.4 小玻璃管．25 mm×4 mm，帶帽。

3.5 試管，10 mL，具磨口塞，實際能盛15 mL至滿。

6 4 試劑

本標準所用試劑除另有說明者外，均爲分析純試劑。

4.1 實驗用水：去離子水或經全玻璃蒸餾器重蒸的水。

4.2 硫酸，ρ₂₀=1.84 g/mL。

4.3 甲酸．85%（m/m）。

4.4 連二亞硫酸鈉（Na₂S₂O₄）。

4.5 氮氣，高純。

4.6 氧氣，高純。

4.7 一氧化碳純氣，鋼瓶裝或自制。製備方法：在裝有滴液漏斗和氣體導出管的燒瓶中加入甲酸（4.3）．自滴液漏斗滴加濃硫酸，產生的一氧化碳通過內裝氫氧化鈉水溶液（4.8）的洗氣瓶及緩衝瓶後通入樣品液中。操作應在良好的通風櫥內進行。

4.8 氫氧化鈉溶液，20 g/L。

4.9 血液稀釋液，0.02 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液。

4.10 肝素溶液，5 g/L。

7 5 採樣、運輸和保存

取末捎血約10μL，直接注入到小玻璃瓶中（事先加入5 g/L肝素溶液40μL），立即加帽，旋轉混勻以防凝血。於保溫瓶中加冰運送，置冰箱冰盒內（-8C）保存。一週內分析完畢。

8 6 分析步驟

8.1 6.1 摩爾吸光係數的測定

摩爾吸光係數不易測定。但在本法計算中，可用同一濃度的血樣製得Hb及HbCO，測其在420 nm，430 nm下的吸光值來代替，作爲常數。測定方法如下：

取不吸菸健康人血（肝素抗凝）用水稀釋5倍。取0.3 mL加Tris稀釋液（4.9）至90 mL通氧氣30 min。從中取4份，每份15 mL於具塞試管中。其中兩份通氮氣10 min以除去過剩的氧，得到HbO2液。另兩份通純一氧化碳氣10 min，得到HbCO液。立即將HbO2、HbCO製備液分別轉入內盛60 mg連二亞硫酸鈉的具塞試管中，混勻，放置10 min測量。讀取430 nm和420 nm的吸光度值，代替摩爾吸光係數（以下簡稱吸光常數）。

8.2 6.2 樣品處理和測定

將冷藏的血樣於室溫放置，用液體混合器混勻。迅速取10μL（二個平行樣），加入內盛15 mLTris溶液（4.9）的具塞試管中（若採樣後隨即分析，可直接取血10μL放入內盛15 mLTris溶液的試管中），加入60 mg連二亞硫酸鈉，輕輕混勻放置10 min．用10 mm比色杯以試劑空白爲參比，測其在420 nm和430 nm處的吸光度值。

9 7 計算

按下式計算血中HbCO的濃度。

式中：X——血中碳氧血紅蛋白的濃度，%；

A₄₂₀——血樣在420 nm的吸光度讀數；

A₄₃₀——血樣在430 nm的吸光度讀數；

k₁——HbCO在420 nm的吸光常數（6.1）；

k₂——HbCO在430 nm的吸光常數（6.1）；

k₃——Hb在420 nm的吸光常數（6.1）；

k₄——Hb在430 nm的吸光常數（6.1）。

10 8 說明

8.1 本法檢測限（0.02吸光度對應的濃度）爲2%HbCO。測定範圍：2%～70.5%HbCO。精密度：批間變異係數爲1.9%～5.6%（HbCO濃度爲9.9%、36.6%、56.8%，n=6）。準確度：中毒病人血樣加已知HbCO濃度血測定回收率，平均爲95.8%（三個濃度，n=8）。

8.2 本法測定所依據的Hb與HbCO含量比例與血紅蛋白含量高低無關，因此取血量不需要很準確。吸光度常數測定後只要儀器波長穩定，可較長時間使用。

8.3 空氣中有大量氧氣，所以血樣及製成的待測液接觸空氣越少越好。實驗證明含HbCO 20%及近飽和HbCO的待測液，其容器上端空氣分別爲5～6 mL及20 mL時，較裝滿或近滿者，測定結果HbCO平均下降4.5%及10.2%（n=6）。

8.4 非高純級的鋼瓶氧氣和氮氣含有微量的一氧化碳。製備HbO₂時應通過加熱至80～100 C的1 cm×10 cm霍加拉特管除去之。

8.5 連二亞硫酸鈉遇水易分解。應避光密封保存，臨用現稱。如試劑放置過久可按附錄A（補充件）方法標定。

11 附錄A 連二亞硫酸鈉含量測定方法（補充件）

11.1 A1 試劑

A1.1 碘，0.1mol/L標準溶液。

A1.2 酚酞．10 g/L乙醇溶液。

A1.3 甲醛，250 g/L鹼性甲醛溶液，用NaOH將甲醛溶液的pH調至8～9。

A1.4 冰乙酸，5%（V/V）溶液。

A1.5 可溶性澱粉，10 g/L溶液。

11.2 A2 測定

用預先盛有15 mL鹼性甲醛溶液（A1.3）的30 mL高型稱量瓶，稱取約1g樣品（稱重至0.002 g）。待樣品充分溶解後移於250 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，吸出25 mL置於錐形瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，吸出25 mL置於錐形瓶中。加5 mL乙酸溶液（A1.4），2 mL澱粉溶液（A1.5），用0.1 mol/L碘溶液（A1.1）滴定至藍色爲終點。

11.3 A3 計算

連二亞硫酸鈉的百分含量按式（A1）計算：

式中：

c——碘溶液的濃度，mol/L；

V——滴定用去碘溶液之體積，mL;

m——稱取試樣之質量，g；

0.04352——與1.00 mL碘標準溶液相當的以克表示的連二亞硫酸鈉的質量。

12 附加說明：

本標準由衛生部衛生監督司提出。

本標準由中國預防醫學科學院勞動衛生與職業病研究所和天津防病中心負責起草。

本標準主要起草人馬相民、線引林。

本標準由衛生部委託技術歸口單位中國預防醫學科學院勞動衛生與職業病研究所負責解釋。